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落满夏天

银虫 (正式写手)

[求助] 了解蛋白质性质及其熟悉电泳的高手请进!

小弟做一种蛋白的电泳时,遇到一个问题,在主条带的下面有两条杂带,但是同一样品做分子筛液相分析就没有,因此我判断是降解条带,该蛋白分子量大概是20000多点,等电点大概是11。降解带分子量在一万五左右,有时候有两条,我们用的是变性SDS-Page ,蛋白缓冲液是PH 为7.0的Pb 。不知道是什么原因降解,处理的时候是加处理液100度水浴。不知道大家有没有解决蛋白电泳降解的经验,小弟感激不尽了。蛋白纯化时,离子交换和分子筛都是过的。
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星星之火,可以燎原
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落满夏天

银虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by lzgxgz at 2012-01-10 12:49:12:
分子筛液相的灵敏度没有电泳高,你要是做反相,也许比电泳纯度还低。
蛋白破坏应该是样品缓冲液中的巯基物和sds,我觉得你是纯化的问题,应该是样品不纯。
你可以去除样品缓冲液和电泳缓冲液中的巯基物和sds,跑 ...

样品缓冲液已经是最后的原液,应该没有巯基物了,sds我在考虑,是不是破坏了蛋白结构,原液里没有,电泳缓冲液和处理液是有的。另外该蛋白没有二硫键,活性一直不好,也还在找问题。先谢谢了。
星星之火,可以燎原
8楼2012-01-11 16:32:58
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流! 2012-01-09 19:59:24
落满夏天(金币+1): 2012-01-11 16:33:24
可能蛋白质样品 是多聚体。靠二硫键结合,在SDS作用下会变性成单聚体。如抗体在SDS PAGE 中就有两条带。
2楼2012-01-09 18:49:51
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
落满夏天(金币+2): 2012-01-11 16:33:12
分子筛液相的灵敏度没有电泳高,你要是做反相,也许比电泳纯度还低。
蛋白破坏应该是样品缓冲液中的巯基物和sds,我觉得你是纯化的问题,应该是样品不纯。
你可以去除样品缓冲液和电泳缓冲液中的巯基物和sds,跑个电泳看看。
3楼2012-01-10 12:49:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.会不会是Marker 在上完样 加缓冲液的时候 溢到相邻的样品槽里
2.沸水加热处理样品没有什么错误,你是怎么确定他会出现降解的可能啊
4楼2012-01-10 16:36:19
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