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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » overlap PCR做不出来呐。。。。
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651424759

新虫 (初入文坛)

[求助] overlap PCR做不出来呐。。。。

连接两个片段，分别PCR均P出来，连接做不出来，试过好几次了。片段分别为1500和3000，变性时间2min，延伸5min。求助各位前辈。。。不甚感激！！！
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1楼 2012-01-09 10:09:42
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回帖置顶 ( 共有1个 )

匿名

用户注销 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2012-01-09 17:50:25
651424759(金币+10): ★★★★★最佳答案 各方面的情况都分析到啦，O(∩_∩)O谢谢 2012-01-12 09:44:00
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 根据楼主反馈，授予EPI！ 2012-01-17 21:18:54
本帖仅楼主可见
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4楼2012-01-09 15:11:00
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 很专业哦，值得学习 2012-01-09 13:36:08
OVERLAPPING PCR一般来说应该分为三步，第一步正是楼主说的分别P两个片段，第二步应该是不加两端引物以两个片段的PCR产物为模板进行3-5个循环（此步骤退火温度可以低点），第三步是在第二步反应终止时加入两端引物条件自定。关键还是退火温度的控制，有时候你P不出来不一定就是你的条件不好。我也试过不经过第二步直接P，也有成功的时候。如果实验室经费比较充裕还是买试剂盒吧，大约50元一次。你也可以把你的PCR条件附上，大家都看看怎么样。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-01-09 12:44:15
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+3): 鼓励交流！不过融合后的量一般很少，也可以不纯化直接作为模板大量扩增的。 2012-01-09 17:50:14
1、扩增A: 1.5k和B：3k的两个片段，纯化后备用
2、以纯化后的A、B片段为模板，以A的5‘端引物和B的3’端引物来进行重叠PCR
3、PCR产物胶回收，切4.5K片段纯化。
4、以该片段为模板，大量扩增
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3楼2012-01-09 14:12:26
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wk990240

新虫 (初入文坛)
如果条件充许，可以分钟克隆两个片段，比如A和B，并且在A的3端和B的5端加上共有的酶切位点，直接两个片段回收后，同时连进表达载体。我经常这样操作，没有大问题的。祝楼主成功。
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15楼2012-05-28 14:36:34
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00
1、分别扩增两个片段，纯化后备用
2、以纯化后的两个片段为模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物来进行重叠PCR。正常情况下就可以扩增出条带专一的目的条带了。如果目的条带很弱可以进行步骤3.
3、P ...

我的融合PCR两个月前偶然出来一次，自从产物用完之后再没有出来过。逐渐摸索条件认为是模板的原因。现在通过转化挑单克隆获得了非常单一的PCR模板。但是还是扩增不出来。我的两个片段均为1.5kb左右，我配的12.5ul的体系，模板各加100ug，使用两步PCR，PCR后跑胶，总是在1.5kb出现比较亮的带，然后自点样孔到1.5kb处很弥散。不知你遇到过这样的情况没，怎么解决
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17楼2012-08-13 21:42:09
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651424759

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2012-01-09 12:44:15:
OVERLAPPING PCR一般来说应该分为三步，第一步正是楼主说的分别P两个片段，第二步应该是不加两端引物以两个片段的PCR产物为模板进行3-5个循环（此步骤退火温度可以低点），第三步是在第二步反应终止时加入两端引物 ...

非常感谢！实验室的师姐说没必要进行第二步，我就省略了。两个引物的退火温度分别为61.99和63.80，我试过退火温度为60,58，都没有P出来呢。

体系是：Buffer         5                     条件是：初始变性  94       6min
           dNTP（10mM）1.5                           变性      94         2min
            primerA       1                                退火      58/60     1min10s
            primerB       1                                 延伸      72         5min                     
           TemplateA   1                                 32cycle
           templateB    1                                 最终延伸    72       15min
           Enzyme        1
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5楼2012-01-09 15:20:28
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651424759

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by fwks3518 at 2012-01-09 14:12:26:
1、扩增A: 1.5k和B：3k的两个片段，纯化后备用
2、以纯化后的A、B片段为模板，以A的5‘端引物和B的3’端引物来进行重叠PCR
3、PCR产物胶回收，切4.5K片段纯化。
4、以该片段为模板，大量扩增

嗯嗯，就是第2步做不出来呢。。。
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6楼2012-01-09 15:21:26
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651424759

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00:
1、分别扩增两个片段，纯化后备用
2、以纯化后的两个片段为模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物来进行重叠PCR。正常情况下就可以扩增出条带专一的目的条带了。如果目的条带很弱可以进行步骤3.
3、 ...

非常感谢！我的重叠部位是27bp，退火温度可以降低到什么程度呢？
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7楼2012-01-09 15:27:10
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2012-01-09 17:50:44
重叠27已经不少了啊，做个退火温度的梯度吧，同一条件可以多试几次。不一定就是条件的原因
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
8楼2012-01-09 16:28:47
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skyseaapple

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励新虫友发帖！ 2012-01-10 13:47:50
楼主可以多加你的片段A与片段B，然后再试个梯度，应该没什么问题的
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9楼2012-01-10 09:52:42
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clfhnb

新虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励新虫交流！ 2012-01-17 21:19:29
第一次的PCR产物纯化最好用切胶的方式纯化。。。
重叠延伸的时候注意两个PCR产物的比例  ，一般是1:1..
用一步法的重叠延伸比较好。。。
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10楼2012-01-17 15:35:56
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