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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » overlap PCR做不出来呐。。。。
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
★ ★
西瓜(金币+2): 荣版，给力啊！ 2012-01-19 18:16:12
不知道LZ是用什么酶扩的，不需要这么长时间的变性和延伸也可以的
   如果我来扩的话条件是：初始变性  96     6min
                            变性      95        20s
                          退火      58/60     20s
                             延伸      72        2min                     
                                            20---25cycle
                      最终延伸    72       5min

话说要是实在不好扩，可以分段重组到载体里
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
11楼2012-01-19 11:32:41
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56:
第一次的PCR产物纯化最好用切胶的方式纯化。。。
重叠延伸的时候注意两个PCR产物的比例  ，一般是1:1..
用一步法的重叠延伸比较好。。。

PCR产物的比例是1：1，如果两个片段长度不同，如何保证1:1, 怎么测定DNA的浓度，我看一般的方法均是测定DNA的质量浓度。而试验中所需的应该是摩尔浓度吧，这个如何测定
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12楼2012-02-24 10:04:17
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)
除了楼上说的那些可能外，也可能因为两个片段本身的关系扩不出。我最近几个月也在做一个overlap PCR，改了很多条件，设计了多对不同的引物，就是没有作出来。以前做类似的东西都是一次成功的。肯定是目的片段本身有什么问题了，虽然我目前还不知道具体是什么
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13楼2012-02-24 13:00:27
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR产物纯化最好用切胶的方式纯化。。。
重叠延伸的时候注意两个PCR产物的比例  ，一般是1:1..
用一步法的重叠延伸比较好。。。

在做融合PCR的时候，一般的比例是1:1，但是我对1：1还有些疑问，不知能否给予解答。1：1指的是DNA片段的总浓度呢，还是片段的分子摩尔数。比如说，一个3kb的片段和1.5kb的片段，在浓度相同的情况下，其分子摩尔数应该是不一样的吧。那么应采用哪一个呢
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14楼2012-05-28 09:18:22
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wk990240

新虫 (初入文坛)
如果条件充许，可以分钟克隆两个片段，比如A和B，并且在A的3端和B的5端加上共有的酶切位点，直接两个片段回收后，同时连进表达载体。我经常这样操作，没有大问题的。祝楼主成功。
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15楼2012-05-28 14:36:34
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rainbow8

新虫 (小有名气)
等摩尔加两个片段试试
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学海无涯，回头是岸
16楼2012-06-06 16:02:23
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00
1、分别扩增两个片段，纯化后备用
2、以纯化后的两个片段为模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物来进行重叠PCR。正常情况下就可以扩增出条带专一的目的条带了。如果目的条带很弱可以进行步骤3.
3、P ...

我的融合PCR两个月前偶然出来一次，自从产物用完之后再没有出来过。逐渐摸索条件认为是模板的原因。现在通过转化挑单克隆获得了非常单一的PCR模板。但是还是扩增不出来。我的两个片段均为1.5kb左右，我配的12.5ul的体系，模板各加100ug，使用两步PCR，PCR后跑胶，总是在1.5kb出现比较亮的带，然后自点样孔到1.5kb处很弥散。不知你遇到过这样的情况没，怎么解决
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17楼2012-08-13 21:42:09
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sd3824289

木虫 (正式写手)
楼主，貌似第二步我也建议你做个梯度试试，做第二轮PCR的时候，由于片段大小发生了变化，GC含量也不一样了，所以退火温度也就跟着发生变化！所以用一下温度梯度很有用的！希望对楼主有帮助！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
18楼2012-08-27 16:28:54
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mikle苏

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR产物纯化最好用切胶的方式纯化。。。
重叠延伸的时候注意两个PCR产物的比例  ，一般是1:1..
用一步法的重叠延伸比较好。。。

一般如何计算1:1呢？是根据比如marker是10ng,然后片段一样亮的是10ng，更亮的往上增，然后以A1*V1=B2*V2计算吗
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努力让自己做的更好
19楼2012-12-13 11:27:38
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于学丹

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR产物纯化最好用切胶的方式纯化。。。
重叠延伸的时候注意两个PCR产物的比例  ，一般是1:1..
用一步法的重叠延伸比较好。。。

你好，我最近也在做重叠PCR，第二步也是出不来，想请问一下两个PCR产物的比例都可以是多少啊，我的片段大小分别是500bp,700bp.
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20楼2013-04-09 08:22:22
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