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經天

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 荧光定量PCR cDNA怎么定量啊？

最近在做荧光定量PCR，取1.0ug的RNA反转以后用NANoDrop测量cDNA的量，ssDNA的值怎么都不一样啊，这样是不是表明反转的效率还是有些差距的啊？这样上机能准确吗，机械重复没有问题，可是生物学重复就会差距很大了，用2ΔΔCt算会影响结果吗？

求高手赐教啊。

[ Last edited by 經天 on 2012-1-6 at 00:10 ]
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1楼2012-01-05 11:00:39
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刘仕博

金虫 (著名写手)
★ ★
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小丹木木(金币+1): 感谢积极交流哦 2012-01-05 15:53:22
經天(金币+8): 2012-01-07 12:08:50
real time PCR看的是基因的相对表达量，它要求在反转录的时候加入相同质量的mRNA，然后看相同量的基本的表达有什么区别。所以LZ在最开始反转录的时候就错了，你仔细看一下反转录试剂盒的使用说明书，它一般都要求加入mRNA的质量而不是体积，这样就可以达到定量的效果。
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2楼2012-01-05 13:20:10
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通缉要饭

金虫 (著名写手)
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小丹木木(金币+1): 鼓励积极交流哦 2012-01-05 15:52:54
一个最简单最准确的方法：用actin引物跑个定量，看看各个样品的CT值，然后根据CT值稀释就可以啦，如果稀释完你还不放心，再用actin跑个定量，看看CT值是不是基本一直就OK啦
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3楼2012-01-05 14:13:24
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heroyl

木虫 (正式写手)
★ ★
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wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2012-01-06 01:09:47
1、不同的样品RNA测浓度，要求浓度是一致的。
2、做内参，最后算的是ΔCt。
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4楼2012-01-05 19:39:46
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 通缉要饭 at 2012-01-05 14:13:24:
一个最简单最准确的方法：用actin引物跑个定量，看看各个样品的CT值，然后根据CT值稀释就可以啦，如果稀释完你还不放心，再用actin跑个定量，看看CT值是不是基本一直就OK啦

这个方法没试过，操作听简单，不过文章不好写了。
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5楼2012-01-06 00:11:51
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
西瓜: 他的意思是说，用相同量的RNA来做反转录。 2012-01-06 18:48:40
引用回帖:
楼: Originally posted by heroyl at 2012-01-05 19:39:46:
1、不同的样品RNA测浓度，要求浓度是一致的。
2、做内参，最后算的是ΔCt。

RNA浓度在提取的时候很难做到一致啊，是算ΔCt，可是生物学重复之间的差距比较大以后数据就不敢用了啊。
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6楼2012-01-06 00:13:41
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通缉要饭

金虫 (著名写手)
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楼: Originally posted by 經天 at 2012-01-06 00:11:51:
这个方法没试过，操作听简单，不过文章不好写了。

我们实验室一般都采用这样的方法。写文章的时候，这部分没有必要描述的这么详细哈，一笔概过。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2012-01-06 07:34:53
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heroyl

木虫 (正式写手)
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西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-01-06 18:49:33
引用回帖:
6楼: Originally posted by 經天 at 2012-01-06 00:13:41:
RNA浓度在提取的时候很难做到一致啊，是算ΔCt，可是生物学重复之间的差距比较大以后数据就不敢用了啊。

将RNA提取之后测浓度，肯定是要稀释之后才做荧光定量啊。
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8楼2012-01-06 11:11:03
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by heroyl at 2012-01-06 11:11:03:
将RNA提取之后测浓度，肯定是要稀释之后才做荧光定量啊。

我测完浓度才能定量到1ug去反转的，为了保险我也测了一下cDNA浓度，这个时候不一样了，做定量根据基因的表达量稀释以后在上机的。
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9楼2012-01-06 21:49:05
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heroyl

木虫 (正式写手)
★
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經天(金币+12): 2012-01-07 12:09:02
引用回帖:
9楼: Originally posted by 經天 at 2012-01-06 21:49:05:
我测完浓度才能定量到1ug去反转的，为了保险我也测了一下cDNA浓度，这个时候不一样了，做定量根据基因的表达量稀释以后在上机的。

其实你不用测CDNA的，一般测CDNA测的不是很精确的。
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10楼2012-01-07 11:11:08
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hpzinc65

金虫 (小有名气)
★
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你测的cDNA浓度和260/280  260/230是多少啊，我的总是跑不出来，测出来浓度一般在一千纳克每微升左右
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11楼2012-11-24 21:32:25
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huangtaotian

新虫 (初入文坛)
★
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CDNA不能用NANODROP测浓度，CDNA液里的背景设置不了。因为blank不是ddH2O，还有5Xbuffer和各种杂质比如说引物和dNTP酶和抑制剂等。
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12楼2013-06-09 21:46:34
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哈皮果果

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
12楼: Originally posted by huangtaotian at 2013-06-09 21:46:34
CDNA不能用NANODROP测浓度，CDNA液里的背景设置不了。因为blank不是ddH2O，还有5Xbuffer和各种杂质比如说引物和dNTP酶和抑制剂等。

您好，想问下，如果不能用nanodrop测浓度，那上机时如何定量呢？
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13楼2014-12-04 23:41:14
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