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經天

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 荧光定量PCR cDNA怎么定量啊？

最近在做荧光定量PCR，取1.0ug的RNA反转以后用NANoDrop测量cDNA的量，ssDNA的值怎么都不一样啊，这样是不是表明反转的效率还是有些差距的啊？这样上机能准确吗，机械重复没有问题，可是生物学重复就会差距很大了，用2ΔΔCt算会影响结果吗？

求高手赐教啊。

[ Last edited by 經天 on 2012-1-6 at 00:10 ]
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1楼2012-01-05 11:00:39
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heroyl

木虫 (正式写手)
★
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經天(金币+12): 2012-01-07 12:09:02
引用回帖:
9楼: Originally posted by 經天 at 2012-01-06 21:49:05:
我测完浓度才能定量到1ug去反转的，为了保险我也测了一下cDNA浓度，这个时候不一样了，做定量根据基因的表达量稀释以后在上机的。

其实你不用测CDNA的，一般测CDNA测的不是很精确的。
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10楼2012-01-07 11:11:08
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刘仕博

金虫 (著名写手)
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小丹木木(金币+1): 感谢积极交流哦 2012-01-05 15:53:22
經天(金币+8): 2012-01-07 12:08:50
real time PCR看的是基因的相对表达量，它要求在反转录的时候加入相同质量的mRNA，然后看相同量的基本的表达有什么区别。所以LZ在最开始反转录的时候就错了，你仔细看一下反转录试剂盒的使用说明书，它一般都要求加入mRNA的质量而不是体积，这样就可以达到定量的效果。
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2楼2012-01-05 13:20:10
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通缉要饭

金虫 (著名写手)
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小丹木木(金币+1): 鼓励积极交流哦 2012-01-05 15:52:54
一个最简单最准确的方法：用actin引物跑个定量，看看各个样品的CT值，然后根据CT值稀释就可以啦，如果稀释完你还不放心，再用actin跑个定量，看看CT值是不是基本一直就OK啦
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2012-01-05 14:13:24
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heroyl

木虫 (正式写手)
★ ★
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wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2012-01-06 01:09:47
1、不同的样品RNA测浓度，要求浓度是一致的。
2、做内参，最后算的是ΔCt。
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4楼2012-01-05 19:39:46
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