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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » southern blot 的酶切问题
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苹果晒太阳

新虫 (小有名气)

[求助] southern blot 的酶切问题

最近在做southern blot ，用CTAB法大量提取水稻DNA，之后用了好几种常见的酶想将其基因组DNA进行酶切，都没法切完全。降低了酶切DNA的量（之前用50μl 体系，DNA量是根据酶的说明书上的浓度换算的，大概5μl左右，5μl酶。现在将DNA量减至1μl），过夜酶切，第二天补酶再切3小时，仍是无法完全酶切。请各位大侠帮忙分析分析。在下感激不尽！

[ Last edited by 苹果晒太阳 on 2012-1-3 at 15:02 ]
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1楼 2012-01-03 14:56:39
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+4): 鼓励发帖交流！ 2012-01-03 17:32:46
对于基因组DNA酶切，难度稍微大些。一般切不彻底的原因是提取的DNA纯度不够。我的经验是反复苯酚、氯仿抽提多次。
在酶切的时候要注意：看说明书上酶的最适宜的浓度和温度还有适宜的缓冲液浓度。楼主不是用的一种酶吧。原则是温度不同要先进行温度低的进行。浓度不同要先进行低浓度的。对于非常难切的，建议10小时补充酶一次。连续切割2天。
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2楼2012-01-03 16:03:49
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baiyongqin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我和你做的是一样的实验，我觉得你的酶切体系太小了，可是适当增大至200ul体系试试。大体系有利于酶切完全。
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3楼2012-01-05 10:46:34
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baiyongqin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2012-01-03 16:03:49:
对于基因组DNA酶切，难度稍微大些。一般切不彻底的原因是提取的DNA纯度不够。我的经验是反复苯酚、氯仿抽提多次。
在酶切的时候要注意：看说明书上酶的最适宜的浓度和温度还有适宜的缓冲液浓度。楼主不是用的一种 ...

请问楼主，第二天不加酶时是不是同时也要补加相应量的buffer呢？
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4楼2012-01-05 10:48:38
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baiyongqin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
telomerase: 金币+2, 欢迎交流！ 2012-03-17 15:50:20
CTAB提取水稻基因组DNA时用的酚仿=25:24:1的溶液分层了吗？你是不是取得下层，而没有混匀了再取？
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5楼2012-01-05 10:49:55
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by baiyongqin at 2012-01-05 10:48:38:
请问楼主，第二天不加酶时是不是同时也要补加相应量的buffer呢？

不需要，buffer的作用无非就2个，一个是保持溶液ph，第二是保证酶的活性，具体的原理我忘记了。补充酶就是为了保证酶的活力数一定。
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6楼2012-01-05 17:24:55
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加大体系到400Ul,加40 UL的酶量,酶切24小时后检测没有主条带或弥散条带明显即可,无水乙醇沉淀40UL溶解上样,有时候你很难酶切完全
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7楼2012-03-17 11:35:56
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baiyongqin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:35:56
加大体系到400Ul,加40 UL的酶量,酶切24小时后检测没有主条带或弥散条带明显即可,无水乙醇沉淀40UL溶解上样,有时候你很难酶切完全

400Ul,加40 UL的酶量，酶量太大了吧，我一般是200ul体系，5ul酶
（20u/ul），酶切过夜即可。
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8楼2012-06-13 16:10:27
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suifeng91

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yqbter: 金币+5, 鼓励回帖！ 2012-06-15 13:31:13
1、一般原则：酶切效率要考虑酶自身因素，底物（DNA）浓度，底物来源（原核、真核？），底物与酶的比例，总buffer离子浓度（可以考虑用水洗脱DNA），甘油浓度等
2、基因组DNA酶切，强烈建议高浓度内切酶（考虑品牌）
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人生不是一场物质的盛宴，而是一次灵魂的修炼，使它在谢幕之时比开幕之初更为高尚。
9楼2012-06-15 12:54:41
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梅岸芷汀兰

新虫 (初入文坛)
有收获啊
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10楼2012-12-27 15:40:40
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