24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 2460  |  回复: 9

苹果晒太阳

新虫 (小有名气)

[求助] southern blot 的酶切问题

最近在做southern blot ,用CTAB法大量提取水稻DNA,之后用了好几种常见的酶想将其基因组DNA进行酶切,都没法切完全。降低了酶切DNA的量(之前用50μl 体系,DNA量是根据酶的说明书上的浓度换算的,大概5μl左右,5μl酶。现在将DNA量减至1μl),过夜酶切,第二天补酶再切3小时,仍是无法完全酶切。请各位大侠帮忙分析分析。在下感激不尽!

[ Last edited by 苹果晒太阳 on 2012-1-3 at 15:02 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+4): 鼓励发帖交流! 2012-01-03 17:32:46
对于基因组DNA酶切,难度稍微大些。一般切不彻底的原因是提取的DNA纯度不够。我的经验是反复苯酚、氯仿抽提多次。
在酶切的时候要注意:看说明书上酶的最适宜的浓度和温度还有适宜的缓冲液浓度。楼主不是用的一种酶吧。原则是温度不同要先进行温度低的进行。浓度不同要先进行低浓度的。对于非常难切的,建议10小时补充酶一次。连续切割2天。
2楼2012-01-03 16:03:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baiyongqin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我和你做的是一样的实验,我觉得你的酶切体系太小了,可是适当增大至200ul体系试试。大体系有利于酶切完全。
3楼2012-01-05 10:46:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baiyongqin

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2012-01-03 16:03:49:
对于基因组DNA酶切,难度稍微大些。一般切不彻底的原因是提取的DNA纯度不够。我的经验是反复苯酚、氯仿抽提多次。
在酶切的时候要注意:看说明书上酶的最适宜的浓度和温度还有适宜的缓冲液浓度。楼主不是用的一种 ...

请问楼主,第二天不加酶时是不是同时也要补加相应量的buffer呢?
4楼2012-01-05 10:48:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baiyongqin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
telomerase: 金币+2, 欢迎交流! 2012-03-17 15:50:20
CTAB提取水稻基因组DNA时用的酚仿=25:24:1的溶液分层了吗?你是不是取得下层,而没有混匀了再取?
5楼2012-01-05 10:49:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qingyuansw20

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by baiyongqin at 2012-01-05 10:48:38:
请问楼主,第二天不加酶时是不是同时也要补加相应量的buffer呢?

不需要,buffer的作用无非就2个,一个是保持溶液ph,第二是保证酶的活性,具体的原理我忘记了。补充酶就是为了保证酶的活力数一定。
6楼2012-01-05 17:24:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
加大体系到400Ul,加40 UL的酶量,酶切24小时后检测没有主条带或弥散条带明显即可,无水乙醇沉淀40UL溶解上样,有时候你很难酶切完全
7楼2012-03-17 11:35:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baiyongqin

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:35:56
加大体系到400Ul,加40 UL的酶量,酶切24小时后检测没有主条带或弥散条带明显即可,无水乙醇沉淀40UL溶解上样,有时候你很难酶切完全

400Ul,加40 UL的酶量,酶量太大了吧,我一般是200ul体系,5ul酶
(20u/ul),酶切过夜即可。
8楼2012-06-13 16:10:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

suifeng91

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yqbter: 金币+5, 鼓励回帖! 2012-06-15 13:31:13
1、一般原则:酶切效率要考虑酶自身因素,底物(DNA)浓度,底物来源(原核、真核?),底物与酶的比例,总buffer离子浓度(可以考虑用水洗脱DNA),甘油浓度等
2、基因组DNA酶切,强烈建议高浓度内切酶(考虑品牌)
人生不是一场物质的盛宴,而是一次灵魂的修炼,使它在谢幕之时比开幕之初更为高尚。
9楼2012-06-15 12:54:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梅岸芷汀兰

新虫 (初入文坛)

有收获啊
10楼2012-12-27 15:40:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 苹果晒太阳 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302分求调剂 +4 凡语祈愿 2026-04-08 5/250 2026-04-08 22:03 by 土木硕士招生
[考研] 085501机械英二77总分294求调剂,接受跨专业学习 +5 守法公民亓纪 2026-04-08 5/250 2026-04-08 21:19 by bljnqdcc
[考研] 388求调剂 +6 四川王涛 2026-04-07 8/400 2026-04-08 00:17 by JourneyLucky
[考研] 081700化学工程与技术 一志愿中海洋 323 求调剂学校 +19 披星河 2026-04-03 19/950 2026-04-07 15:14 by 尽舜尧1
[考研] 化工调剂303分,过四级 +34 栖梧待风 2026-04-02 34/1700 2026-04-07 12:30 by 1018329917
[考研] 372分材料与化工(085600)英二数二求调剂 +4 蓝笺片 2026-04-06 4/200 2026-04-07 12:30 by dongzh2009
[考研] 295求调剂 +18 xndjjj 2026-04-04 19/950 2026-04-07 11:02 by wangjy2002
[考研] 材料调剂 +5 小刘同学吖吖 2026-04-06 5/250 2026-04-06 18:34 by sherry_1901
[考研] 求调剂到材料 +5 程9915 2026-04-06 5/250 2026-04-06 15:21 by yulian1987
[考研] 0817化学工程与技术求调剂,一志愿中海洋319 +14 lv945 2026-04-04 14/700 2026-04-06 10:20 by 蓝云思雨
[考研] 324求调剂 +3 k可乐 2026-04-05 4/200 2026-04-06 09:54 by 蓝云思雨
[考研] 材料专硕322分 +10 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-04 10/500 2026-04-05 21:22 by 学员8dgXkO
[考研] 083200 333求调剂 +3 十二!! 2026-04-04 3/150 2026-04-05 08:28 by barlinike
[考研] 324求调剂 +14 想上学求调 2026-04-02 15/750 2026-04-04 20:31 by 无际的草原
[考研] 材料专业383求调剂 +8 郭阳阳阳成 2026-04-03 8/400 2026-04-04 10:29 by Rednal.
[考研] 考研调剂 +3 15615482637 2026-04-03 3/150 2026-04-03 22:50 by ms629
[考研] 学硕288调剂!!! +3 小王xw123 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:20 by 啵啵啵0119
[考研] 求调剂 +8 akdhjs 2026-04-03 8/400 2026-04-03 18:17 by 戴维ING
[考研] 303求调剂 +3 一色清羽 2026-04-02 4/200 2026-04-03 10:22 by 蓝云思雨
[考研] 275学硕081000服从调剂到其他专业,保不住本专业了 +7 一只小小水牛 2026-04-02 8/400 2026-04-02 14:23 by alice-2022
信息提示
请填处理意见