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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 环形质粒酶切电泳图分析求解
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 环形质粒酶切电泳图分析求解

图注：上一排左起分别为maker，对照原始质粒，所有酶均购自Fermentas公司，E1.1，E1.2，E1.3分别为同一个酶(BamHI)不同购买时间的样品；E2为AvrII；E3为Bst119I；E4.2为酶SpeI。
下排左起分别为maker；对照原始质粒；1.1，1.2，1.3为E1.1，E1.2，E1.3分别与E2双酶切(目的条带大小应为1500bp与5800bp)；2.1，2.2为E4.1，E4.2分别与E3双酶切(两个酶切位点间隔94bp)，E4.1为酶SpeI。
其他：maker为1Kb ladder，质粒大小约7300bp，最大条带为10000，最小片段为250bp。BamHI有星号活性，其余酶均可使用同一种buffer。由于电泳时间较长(90V，50min)，下排双酶切小片段(94bp)可能已经跑过，大片段(约7200bp)稍快于未经酶切片段。
问题如下：1、为何BamHI单酶切会出现如此多的条带，为了双酶切我采用的Tango Buffer，可能会导致非特异性增多？预实验时做的与E2的双酶切没有出现如此多的杂带。
2、E2，E3的单酶切是否算成功？跑的要比对照慢，看了几个帖子，有的说线性的要比环形的慢，有的说要快，我有些迷糊。
3、E4.1，E4.2的单酶切是否成功？貌似跑的也比对照要慢一些。
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1楼 2011-12-31 00:20:41
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zehego

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-12-31 14:30:19
BamHI有星活性，酶切时间长很容易产生非特异位点的酶切，如果你怕切不开，可以加大酶的用量，但是酶切时间一点要短，你可以做一个时间梯度看看。个人觉得先切3h试试，不行就缩短至30min。只去掉94bp的酶切比较难看得出来；你最大的Marker是不是10Kb的？你最大的Marker都在你酶切条带以下，感觉没有切开。你可以做长一点的胶，浓度做大一点，可以把Marker跑开，同时跑胶时间长可以把酶切前后的条带还是能分开。
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3楼2011-12-31 09:48:58
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zehego

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2012-01-04 12:20:39
faile18(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-10 06:18:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-01 06:31:23:
酶切时间大概是6.5h，主要是我要采用双酶切，30min估计切不开吧？酶量较之前已经提高了，15微升体系，酶1微升，质粒0,5微升。最大的marker是10Kb的，这也是我一直纠结的事情，载体不是我构建的，我是从质粒提取开 ...

你是15微升体系，每种酶各加1微升，还是两种酶加起来1微升？加酶的时候有一点必须注意的是，酶的总量不能超过酶切体系的10%,因为酶里面有50%的甘油，甘油终体积超过5%时会阻碍酶切的。另外你可以试试分别单酶切，做一个时间梯度看看能不能切开，如果单酶切都没切开，你最好是换新的酶。记得酶的体积不能超过10%。质粒刚提出来酶切前跑的胶是无法跟Marker比的，提出来的质粒一般有3种构型，凝胶电泳时是很难看得出来它的大小。
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8楼2012-01-04 09:20:15
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zehego

木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流~可以跟maker比较，如果marker里更小的条带都没跑出去，那可能真的是条带太淡了。 2012-01-06 18:54:35
引用回帖:
11楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-05 22:44:37:
还有个问题请教一下，我昨天换了BamHI的buffer双酶切试了一下，电泳的时候，15min的时候取出来看了一下胶，双酶切可以看到前面有条带，45min之后这条带没了，不知道是跑过了的原因还是怎么，我不得其解啊

如果是100bp左右的条带估计是跑出去了；如果是比较大的条带，看不到的话，个人感觉是条带应该还在，但是可能结合的EB不能再发荧光，或者能发的荧光很弱，我们看不到。我以前也试过，不过也不清楚为什么会出现这种情况。估计是这个原因。希望其他人能给个解释。
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13楼2012-01-06 17:49:04
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zehego

木虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木(金币+2): 鼓励积极应助哦 2012-01-07 16:35:31
引用回帖:
15楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-07 06:51:15:
这个正常且出来的带应该是1500bp左右，后来别人教了一招，把图像reverse一下，然后再调整一下对比度就能看到那条带了，可能是浓度较低，不那么明显。

浓度低也就是结合的EB量小，肯定发光弱。酶切时如果只是检测质粒可以做小体系然后全部都跑胶，反正留着也没多大用处；如果酶切后要回收再做连接还是多切，全部点样跑胶后看清楚了再切胶回收。而且看胶时跟点的Marker条带比对大概能猜出来你酶切条带的量。祝你实验顺利^_^
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19楼2012-01-07 16:22:12
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zehego

木虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-10 06:11:26:
预实验做的15微升体系的小量酶切，全部都点样了，这个区段双酶切的问题已经解决了，大量酶切回收背景可以明显的看到切下来的两条带。但另一个区段的双酶切，切下来96bp的片段我始终没有观察到，可能是相比较于十 ...

MetaPhor我没做过，你可以试试。我觉得你看不到的问题主要是这个条带的DNA浓度不够；跑胶不能跑太长时间，以防跑出胶。
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22楼2012-01-11 10:11:26
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