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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 环形质粒酶切电泳图分析求解
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faile18

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by zehego at 2012-01-04 09:20:15:
你是15微升体系，每种酶各加1微升，还是两种酶加起来1微升？加酶的时候有一点必须注意的是，酶的总量不能超过酶切体系的10%,因为酶里面有50%的甘油，甘油终体积超过5%时会阻碍酶切的。另外你可以试试分别单酶切， ...

还有个问题请教一下，我昨天换了BamHI的buffer双酶切试了一下，电泳的时候，15min的时候取出来看了一下胶，双酶切可以看到前面有条带，45min之后这条带没了，不知道是跑过了的原因还是怎么，我不得其解啊
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11楼2012-01-05 22:44:37
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-05 22:44:37:
还有个问题请教一下，我昨天换了BamHI的buffer双酶切试了一下，电泳的时候，15min的时候取出来看了一下胶，双酶切可以看到前面有条带，45min之后这条带没了，不知道是跑过了的原因还是怎么，我不得其解啊

你条带多大？
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12楼2012-01-05 22:58:38
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zehego

木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流~可以跟maker比较，如果marker里更小的条带都没跑出去，那可能真的是条带太淡了。 2012-01-06 18:54:35
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11楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-05 22:44:37:
还有个问题请教一下，我昨天换了BamHI的buffer双酶切试了一下，电泳的时候，15min的时候取出来看了一下胶，双酶切可以看到前面有条带，45min之后这条带没了，不知道是跑过了的原因还是怎么，我不得其解啊

如果是100bp左右的条带估计是跑出去了；如果是比较大的条带，看不到的话，个人感觉是条带应该还在，但是可能结合的EB不能再发荧光，或者能发的荧光很弱，我们看不到。我以前也试过，不过也不清楚为什么会出现这种情况。估计是这个原因。希望其他人能给个解释。
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13楼2012-01-06 17:49:04
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-05 22:58:38:
你条带多大？

通过reverse，然后调整了一下对比度我看到那条带了，只不过亮度较弱，谢谢
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14楼2012-01-07 06:49:33
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zehego at 2012-01-06 17:49:04:
如果是100bp左右的条带估计是跑出去了；如果是比较大的条带，看不到的话，个人感觉是条带应该还在，但是可能结合的EB不能再发荧光，或者能发的荧光很弱，我们看不到。我以前也试过，不过也不清楚为什么会出现这种 ...

这个正常且出来的带应该是1500bp左右，后来别人教了一招，把图像reverse一下，然后再调整一下对比度就能看到那条带了，可能是浓度较低，不那么明显。
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15楼2012-01-07 06:51:15
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-05 22:58:38:
你条带多大？

我需要的是背景哈，切下来的片段大概是1500bp，后来找到这个片段了，小试的时候酶切还是成功了，大量酶切的时候竟然出现了两条杂带。
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16楼2012-01-07 07:44:51
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faile18

金虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by zehego at 2012-01-06 17:49:04:
如果是100bp左右的条带估计是跑出去了；如果是比较大的条带，看不到的话，个人感觉是条带应该还在，但是可能结合的EB不能再发荧光，或者能发的荧光很弱，我们看不到。我以前也试过，不过也不清楚为什么会出现这种 ...

我做了另外两个酶，Bsp119I(BstBI)和BcuI(SpeI)，这两个酶可以共用Buffer Tango，这个双酶切切下来的应该一段93bp，我尝试过电泳十分钟就看胶，但是没有观察到过这条带，不知是否与这个片段的浓度相关？
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17楼2012-01-07 07:55:37
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励积极应助哦 2012-01-07 16:34:40
你算过你切下的2个片段的分子量比么？你根据你质粒的总浓度算一下看你的93bp应该是多少浓度，一般你看你购买的Marker最亮的是30ng/微升（以前用的什么公司的是这样 具体哪个公司忘记了），你酶切完去跑胶不是全都点只是点了一部分，你也得按比例算下93bp应该是多少浓度就知道大致能不能看到了。另外单酶切最好用特定BUFF，双酶切就需要看了，这个公司的酶还是不错的
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18楼2012-01-07 09:22:42
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zehego

木虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木(金币+2): 鼓励积极应助哦 2012-01-07 16:35:31
引用回帖:
15楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-07 06:51:15:
这个正常且出来的带应该是1500bp左右，后来别人教了一招，把图像reverse一下，然后再调整一下对比度就能看到那条带了，可能是浓度较低，不那么明显。

浓度低也就是结合的EB量小，肯定发光弱。酶切时如果只是检测质粒可以做小体系然后全部都跑胶，反正留着也没多大用处；如果酶切后要回收再做连接还是多切，全部点样跑胶后看清楚了再切胶回收。而且看胶时跟点的Marker条带比对大概能猜出来你酶切条带的量。祝你实验顺利^_^
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19楼2012-01-07 16:22:12
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by zehego at 2012-01-07 16:22:12:
浓度低也就是结合的EB量小，肯定发光弱。酶切时如果只是检测质粒可以做小体系然后全部都跑胶，反正留着也没多大用处；如果酶切后要回收再做连接还是多切，全部点样跑胶后看清楚了再切胶回收。而且看胶时跟点的Ma ...

预实验做的15微升体系的小量酶切，全部都点样了，这个区段双酶切的问题已经解决了，大量酶切回收背景可以明显的看到切下来的两条带。但另一个区段的双酶切，切下来96bp的片段我始终没有观察到，可能是相比较于十几kb的背景太小了以至于观察不到？我试过4%的胶，有人建议试一下3% 的metaphor， 不知您有何意见
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20楼2012-01-10 06:11:26
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