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faile18

金虫 (小有名气)

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18楼: Originally posted by 393658000 at 2012-01-07 09:22:42:
你算过你切下的2个片段的分子量比么?你根据你质粒的总浓度算一下看你的93bp应该是多少浓度,一般你看你购买的Marker最亮的是30ng/微升(以前用的什么公司的是这样 具体哪个公司忘记了),你酶切完去跑胶不是全都 ...

感谢您的回复。确实是我没有算过他们之间的比例是多大,或许我15微升的小量酶切体系,确实不足以观察到这条小带,但我是想找个办法,在小量酶切体系中观察到这条带,要不然我没办法确定这个双酶切是否成功。谢谢
21楼2012-01-10 06:17:29
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zehego

木虫 (小有名气)

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20楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-10 06:11:26:
预实验做的15微升体系的小量酶切,全部都点样了,这个区段双酶切的问题已经解决了,大量酶切回收背景可以明显的看到切下来的两条带。但另一个区段的双酶切,切下来96bp的片段我始终没有观察到,可能是相比较于十 ...

MetaPhor我没做过,你可以试试。我觉得你看不到的问题主要是这个条带的DNA浓度不够;跑胶不能跑太长时间,以防跑出胶。
22楼2012-01-11 10:11:26
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diy患者

铁虫 (正式写手)


小丹木木(金币+1): 鼓励交流哦 2012-01-12 08:20:42
buffer居然对酶的性能影响这么大,有点出乎我的意料,星活性导致?

内容我没有太看明白。我就光说说,不同构象速度吧。

07%-1.5%的胶中,由快到慢,以此是超螺旋,线状,解螺旋。其中,线状和解螺旋靠的很近。提取质粒,一般见到的是超螺旋和解螺旋,线状一般见不到,除非放置时间非常长。超螺旋和解螺旋的比例依提取环境和质粒分子量大小而不同,4000bp左右的,分子克隆实验指南的方法,比例大概是10:1,也就是超螺旋占绝大多数。

楼主的只见一条带,有点奇怪,应该是超螺旋的。

至于多大的片段能看到,可以按照和marker的比例大概计算一下,EB染色的极限,印象中10ng吧。

建议第一步确认你看到的质粒到底是何构象,单跑质粒,低浓度胶,跑到底。

我从来没有跑过这么大的质粒,意见仅供参考。
23楼2012-01-11 22:28:05
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
21楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-10 06:17:29:
感谢您的回复。确实是我没有算过他们之间的比例是多大,或许我15微升的小量酶切体系,确实不足以观察到这条小带,但我是想找个办法,在小量酶切体系中观察到这条带,要不然我没办法确定这个双酶切是否成功。谢谢

这一次做了大量双酶切体系,120微升体系,DNA用了10微升,这次效果明显了,但出来的带(约4kb)不是我想看到的,跟之前用Bsp119I单酶切结果有点相似,可能是这个酶切位点不单一吧,但分析出来的酶切位点确实是只有一个,如果是这个原因,双酶切切出来的带应该有很多条,差不多三到四条吧,目前还没找到原因。
24楼2012-01-11 23:39:44
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by zehego at 2012-01-11 10:11:26:
MetaPhor我没做过,你可以试试。我觉得你看不到的问题主要是这个条带的DNA浓度不够;跑胶不能跑太长时间,以防跑出胶。

这一次做了大量双酶切体系,120微升体系,DNA用了10微升,这次效果明显了,但出来的带(约4kb)不是我想看到的,跟之前用Bsp119I单酶切结果有点相似,可能是这个酶切位点不单一吧,但分析出来的酶切位点确实是只有一个,如果是这个原因,双酶切切出来的带应该有很多条,差不多三到四条吧,目前还没找到原因。
25楼2012-01-11 23:40:15
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by diy患者 at 2012-01-11 22:28:05:
buffer居然对酶的性能影响这么大,有点出乎我的意料,星活性导致?

内容我没有太看明白。我就光说说,不同构象速度吧。

07%-1.5%的胶中,由快到慢,以此是超螺旋,线状,解螺旋。其中,线状和解螺旋靠的很近 ...

感谢您的建议。
Buffer确实对酶切体系的影响相当大,这一点你可以参考很多公司提供的信息。还要看质粒是何构像?第一次听说这个情况,孤陋寡闻了,呵呵。试剂盒提出来的质粒应该都是单一构象的吧?我这个质粒,载体是9kb,插入的片段是7kb。
26楼2012-01-11 23:45:44
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