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环形质粒酶切电泳图分析求解
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图注：上一排左起分别为maker，对照原始质粒，所有酶均购自Fermentas公司，E1.1，E1.2，E1.3分别为同一个酶(BamHI)不同购买时间的样品；E2为AvrII；E3为Bst119I；E4.2为酶SpeI。 下排左起分别为maker；对照原始质粒；1.1，1.2，1.3为E1.1，E1.2，E1.3分别与E2双酶切(目的条带大小应为1500bp与5800bp)；2.1，2.2为E4.1，E4.2分别与E3双酶切(两个酶切位点间隔94bp)，E4.1为酶SpeI。 其他：maker为1Kb ladder，质粒大小约7300bp，最大条带为10000，最小片段为250bp。BamHI有星号活性，其余酶均可使用同一种buffer。由于电泳时间较长(90V，50min)，下排双酶切小片段(94bp)可能已经跑过，大片段(约7200bp)稍快于未经酶切片段。 问题如下：1、为何BamHI单酶切会出现如此多的条带，为了双酶切我采用的Tango Buffer，可能会导致非特异性增多？预实验时做的与E2的双酶切没有出现如此多的杂带。 2、E2，E3的单酶切是否算成功？跑的要比对照慢，看了几个帖子，有的说线性的要比环形的慢，有的说要快，我有些迷糊。 3、E4.1，E4.2的单酶切是否成功？貌似跑的也比对照要慢一些。  |
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小丹木木(金币+1): 鼓励交流哦 2012-01-12 08:20:42
小丹木木(金币+1): 鼓励交流哦 2012-01-12 08:20:42
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buffer居然对酶的性能影响这么大，有点出乎我的意料，星活性导致？ 内容我没有太看明白。我就光说说，不同构象速度吧。 07%-1.5%的胶中，由快到慢，以此是超螺旋，线状，解螺旋。其中，线状和解螺旋靠的很近。提取质粒，一般见到的是超螺旋和解螺旋，线状一般见不到，除非放置时间非常长。超螺旋和解螺旋的比例依提取环境和质粒分子量大小而不同，4000bp左右的，分子克隆实验指南的方法，比例大概是10:1，也就是超螺旋占绝大多数。 楼主的只见一条带，有点奇怪，应该是超螺旋的。 至于多大的片段能看到，可以按照和marker的比例大概计算一下，EB染色的极限，印象中10ng吧。 建议第一步确认你看到的质粒到底是何构象，单跑质粒，低浓度胶，跑到底。 我从来没有跑过这么大的质粒，意见仅供参考。 |
23楼2012-01-11 22:28:05
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
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2楼2011-12-31 00:46:07
zehego
木虫 (小有名气)
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3楼2011-12-31 09:48:58
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