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环形质粒酶切电泳图分析求解
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图注：上一排左起分别为maker，对照原始质粒，所有酶均购自Fermentas公司，E1.1，E1.2，E1.3分别为同一个酶(BamHI)不同购买时间的样品；E2为AvrII；E3为Bst119I；E4.2为酶SpeI。 下排左起分别为maker；对照原始质粒；1.1，1.2，1.3为E1.1，E1.2，E1.3分别与E2双酶切(目的条带大小应为1500bp与5800bp)；2.1，2.2为E4.1，E4.2分别与E3双酶切(两个酶切位点间隔94bp)，E4.1为酶SpeI。 其他：maker为1Kb ladder，质粒大小约7300bp，最大条带为10000，最小片段为250bp。BamHI有星号活性，其余酶均可使用同一种buffer。由于电泳时间较长(90V，50min)，下排双酶切小片段(94bp)可能已经跑过，大片段(约7200bp)稍快于未经酶切片段。 问题如下：1、为何BamHI单酶切会出现如此多的条带，为了双酶切我采用的Tango Buffer，可能会导致非特异性增多？预实验时做的与E2的双酶切没有出现如此多的杂带。 2、E2，E3的单酶切是否算成功？跑的要比对照慢，看了几个帖子，有的说线性的要比环形的慢，有的说要快，我有些迷糊。 3、E4.1，E4.2的单酶切是否成功？貌似跑的也比对照要慢一些。  |
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西瓜
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faile18(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-10 06:18:09
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你是15微升体系，每种酶各加1微升，还是两种酶加起来1微升？加酶的时候有一点必须注意的是，酶的总量不能超过酶切体系的10%,因为酶里面有50%的甘油，甘油终体积超过5%时会阻碍酶切的。另外你可以试试分别单酶切，做一个时间梯度看看能不能切开，如果单酶切都没切开，你最好是换新的酶。记得酶的体积不能超过10%。质粒刚提出来酶切前跑的胶是无法跟Marker比的，提出来的质粒一般有3种构型，凝胶电泳时是很难看得出来它的大小。 |
8楼2012-01-04 09:20:15
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10楼2012-01-04 23:23:32
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