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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 环形质粒酶切电泳图分析求解
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 环形质粒酶切电泳图分析求解

图注：上一排左起分别为maker，对照原始质粒，所有酶均购自Fermentas公司，E1.1，E1.2，E1.3分别为同一个酶(BamHI)不同购买时间的样品；E2为AvrII；E3为Bst119I；E4.2为酶SpeI。
下排左起分别为maker；对照原始质粒；1.1，1.2，1.3为E1.1，E1.2，E1.3分别与E2双酶切(目的条带大小应为1500bp与5800bp)；2.1，2.2为E4.1，E4.2分别与E3双酶切(两个酶切位点间隔94bp)，E4.1为酶SpeI。
其他：maker为1Kb ladder，质粒大小约7300bp，最大条带为10000，最小片段为250bp。BamHI有星号活性，其余酶均可使用同一种buffer。由于电泳时间较长(90V，50min)，下排双酶切小片段(94bp)可能已经跑过，大片段(约7200bp)稍快于未经酶切片段。
问题如下：1、为何BamHI单酶切会出现如此多的条带，为了双酶切我采用的Tango Buffer，可能会导致非特异性增多？预实验时做的与E2的双酶切没有出现如此多的杂带。
2、E2，E3的单酶切是否算成功？跑的要比对照慢，看了几个帖子，有的说线性的要比环形的慢，有的说要快，我有些迷糊。
3、E4.1，E4.2的单酶切是否成功？貌似跑的也比对照要慢一些。
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1楼2011-12-31 00:20:41
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2011-12-31 22:16:58
检查下你的酶的过期时间，看看管子上标的expire后面的日期到了没。过期很久的酶会切出乱七八糟的条带的。
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2楼2011-12-31 00:46:07
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zehego

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-12-31 14:30:19
BamHI有星活性，酶切时间长很容易产生非特异位点的酶切，如果你怕切不开，可以加大酶的用量，但是酶切时间一点要短，你可以做一个时间梯度看看。个人觉得先切3h试试，不行就缩短至30min。只去掉94bp的酶切比较难看得出来；你最大的Marker是不是10Kb的？你最大的Marker都在你酶切条带以下，感觉没有切开。你可以做长一点的胶，浓度做大一点，可以把Marker跑开，同时跑胶时间长可以把酶切前后的条带还是能分开。
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3楼2011-12-31 09:48:58
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-12-31 00:46:07:
检查下你的酶的过期时间，看看管子上标的expire后面的日期到了没。过期很久的酶会切出乱七八糟的条带的。

BamHI是用的以前剩下的，应该还没有过期，假期之后我再核对一下，其他的酶都是圣诞之前刚刚订购的
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4楼2012-01-01 06:01:27
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zehego at 2011-12-31 09:48:58:
BamHI有星活性，酶切时间长很容易产生非特异位点的酶切，如果你怕切不开，可以加大酶的用量，但是酶切时间一点要短，你可以做一个时间梯度看看。个人觉得先切3h试试，不行就缩短至30min。只去掉94bp的酶切比较难看 ...

酶切时间大概是6.5h，主要是我要采用双酶切，30min估计切不开吧？酶量较之前已经提高了，15微升体系，酶1微升，质粒0,5微升。最大的marker是10Kb的，这也是我一直纠结的事情，载体不是我构建的，我是从质粒提取开始做的，提出来的质粒，检测确实比10Kb大
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5楼2012-01-01 06:31:23
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guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 补上奖励！ 2012-01-04 12:21:17
做实验以前先看看你的酶切谱图的酶切位点，用DNAMAN看看你的片段用BamHI会切出来多少？我的黏粒就可以切出来你这么多的条带。肯定不是酶的问题，你的酶质量不错的，这个牌子蛮好的。好好看看书和说明书，你的这个酶切30分钟完全够了。理论上15分钟消化完全，而且是保守估计。
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6楼2012-01-01 15:31:30
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by guojianping at 2012-01-01 15:31:30:
做实验以前先看看你的酶切谱图的酶切位点，用DNAMAN看看你的片段用BamHI会切出来多少？我的黏粒就可以切出来你这么多的条带。肯定不是酶的问题，你的酶质量不错的，这个牌子蛮好的。好好看看书和说明书，你的这个 ...

谢谢您的提醒，酶切位点我在选择酶之前就已经确定过了，而且是单一酶切位点，可能是buffer的问题，今天再验证一下
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7楼2012-01-04 00:27:26
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zehego

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2012-01-04 12:20:39
faile18(金币+5): ★★★很有帮助 2012-01-10 06:18:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by faile18 at 2012-01-01 06:31:23:
酶切时间大概是6.5h，主要是我要采用双酶切，30min估计切不开吧？酶量较之前已经提高了，15微升体系，酶1微升，质粒0,5微升。最大的marker是10Kb的，这也是我一直纠结的事情，载体不是我构建的，我是从质粒提取开 ...

你是15微升体系，每种酶各加1微升，还是两种酶加起来1微升？加酶的时候有一点必须注意的是，酶的总量不能超过酶切体系的10%,因为酶里面有50%的甘油，甘油终体积超过5%时会阻碍酶切的。另外你可以试试分别单酶切，做一个时间梯度看看能不能切开，如果单酶切都没切开，你最好是换新的酶。记得酶的体积不能超过10%。质粒刚提出来酶切前跑的胶是无法跟Marker比的，提出来的质粒一般有3种构型，凝胶电泳时是很难看得出来它的大小。
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8楼2012-01-04 09:20:15
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zehego at 2012-01-04 09:20:15:
你是15微升体系，每种酶各加1微升，还是两种酶加起来1微升？加酶的时候有一点必须注意的是，酶的总量不能超过酶切体系的10%,因为酶里面有50%的甘油，甘油终体积超过5%时会阻碍酶切的。另外你可以试试分别单酶切， ...

图中单酶切的泳道，我已做说明。谢谢您的提醒，关于体系中酶量得问题，单酶切是每种酶1微升，双酶切是两种酶加起来1微升，酶总量均没有超过体系的10%.
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9楼2012-01-04 23:22:29
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faile18

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励反馈！换了新buffer就好了？ 2012-01-05 22:57:56
西瓜: 回帖置顶 2012-01-05 22:57:57
关于BamHI酶切条带多且杂的问题，已证实是Buffer所致。
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10楼2012-01-04 23:23:32
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