| 查看: 6479 | 回复: 13 | ||||||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||||||
木左左银虫 (正式写手)
|
[求助]
高GC含量基因片段PCR问题
|
|||||||
|
大家好，我现在克隆一组目的片段，以cDNA为模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超过60%，实验做了2个多月，没有进展，很是苦恼 主要用的大连宝生物的la酶和GCbuffer 我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题： 1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？ 2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？ 3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？ 4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？ 如果哪位师兄师姐有这方面的经验或者是专利方面的信息业希望可以告诉我，小弟不胜感激，谢谢大家！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 PCR技术 | 生物信息学软件应用 | 【分子生物】EPI帖 | 有助于于我的SNP |
| 生物资源 | 基因工程和分子生物学 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有81人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- 关于GC含量高的模板
已经有12人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 基因组中长片段PCR应该注意的几个问题
已经有14人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- pcr，RACE,低表达量基因的克隆
已经有8人回复
- PCR 扩全长
已经有20人回复
- 【求助/交流】菌落PCR求助
已经有23人回复
- 【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带
已经有39人回复
luckyhongli
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 1
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 1164.9
- 散金: 132
- 红花: 6
- 帖子: 292
- 在线: 62.4小时
- 虫号: 1530774
- 注册: 2011-12-09
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
10楼2011-12-10 14:50:22
brightfuture01
木虫之王 (文坛精英)
我爱打老虎
- MolEPI: 14
- 应助: 24 (小学生)
- 贵宾: 1.2
- 金币: 113347
- 散金: 1526
- 红花: 224
- 沙发: 1
- 帖子: 28966
- 在线: 3724.6小时
- 虫号: 464575
- 注册: 2007-11-21
- 性别: GG
- 专业: 神经生物学
【答案】应助回帖
1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金币+5): 非常感谢 2011-12-09 17:01:21
木左左(金币+5): 非常感谢 2011-12-09 17:01:21
|
1，如果是为了表达的话，引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基（在编码的氨基酸不变的情况下）,，这样可以使得引物的退火温度降低。 2，我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果还不错，70%+的GC，有两种GC buffer A 和B，如果A不行的话试试B。 3，Tm高的话，退火温度可以适当设置高一些。变性也可以比95度高那么几度。 4， 这个问题我回答不了。 我的一点建议： 如果PCR产物很弱的话，可以做个胶回收，连T，然后让其在质粒里面复制从而获得大量的目的基因片段。 PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。60%应该不是很难扩增的。 |
2楼2011-12-08 23:32:53
木左左
银虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 436.7
- 散金: 70
- 帖子: 324
- 在线: 103.4小时
- 虫号: 1020700
- 注册: 2010-05-17
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
3楼2011-12-09 17:04:27
luckyhongli
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 1
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 1164.9
- 散金: 132
- 红花: 6
- 帖子: 292
- 在线: 62.4小时
- 虫号: 1530774
- 注册: 2011-12-09
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
【答案】应助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
|
这个问题我在国外的时候也碰到过，当时我扩增一个基因的promoter区，GC含量70%以上，后来解决了： 方法1. 巢式PCR，在目的片段的两端非高GC含量区设计引物，比如可以扩增2500到3000 bp，然后以此为模板进行第二次PCR。 方法2. 换酶，我用过ABI的gold 360，附带GC buffer，效果非常不错。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。 你的问题答复如下： 我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题： 1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？ > 我用Primer3Plus设计引物，效果非常好。引物设计的注意事项较多，在这里关键不要在3‘末端有连续的G或C。 2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？ > ABI的金牌360，额外的GC buffer。 3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？ > 退火温度最高在63或65度，再高也没有好处。 根据酶的不同，变性温度可以在95度5到10分钟。 4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？ > 一般启动子区域或遗传印记区域GC含量较高， 本人博士毕业后在国外做博士后几年，目前在上海一著名大学任教授，具有多年的分子生物学经验 |
4楼2011-12-09 17:45:42
投票:
