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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 高GC含量基因片段PCR问题
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木左左

银虫 (正式写手)

[求助] 高GC含量基因片段PCR问题

大家好，我现在克隆一组目的片段，以cDNA为模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超过60%，实验做了2个多月，没有进展，很是苦恼
主要用的大连宝生物的la酶和GCbuffer
我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题：
1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？
2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？
3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？
4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？
如果哪位师兄师姐有这方面的经验或者是专利方面的信息业希望可以告诉我，小弟不胜感激，谢谢大家！
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1楼 2011-12-08 21:58:28
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luckyhongli

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
这个问题我在国外的时候也碰到过，当时我扩增一个基因的promoter区，GC含量70%以上，后来解决了：
方法1. 巢式PCR，在目的片段的两端非高GC含量区设计引物，比如可以扩增2500到3000 bp，然后以此为模板进行第二次PCR。
方法2. 换酶，我用过ABI的gold 360，附带GC buffer，效果非常不错。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。
你的问题答复如下：

我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题：
1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？
> 我用Primer3Plus设计引物，效果非常好。引物设计的注意事项较多，在这里关键不要在3‘末端有连续的G或C。
2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？
> ABI的金牌360，额外的GC buffer。
3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？
> 退火温度最高在63或65度，再高也没有好处。
  根据酶的不同，变性温度可以在95度5到10分钟。
4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？
> 一般启动子区域或遗传印记区域GC含量较高，
  本人博士毕业后在国外做博士后几年，目前在上海一著名大学任教授，具有多年的分子生物学经验
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请相信坚持的力量
4楼2011-12-09 17:45:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金币+5): 非常感谢 2011-12-09 17:01:21
1，如果是为了表达的话，引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基（在编码的氨基酸不变的情况下）,，这样可以使得引物的退火温度降低。

2，我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果还不错，70%+的GC，有两种GC buffer A 和B，如果A不行的话试试B。

3，Tm高的话，退火温度可以适当设置高一些。变性也可以比95度高那么几度。

4， 这个问题我回答不了。

我的一点建议： 如果PCR产物很弱的话，可以做个胶回收，连T，然后让其在质粒里面复制从而获得大量的目的基因片段。

PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。60%应该不是很难扩增的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-12-08 23:32:53
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luckyhongli

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 确实可行！ 2011-12-13 19:09:24
你也可以采取分段扩增然后再重叠延伸PCR的方法，good luck！
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请相信坚持的力量
10楼2011-12-10 14:50:22
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sunwei57

木虫 (小有名气)
改用PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC buffer
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13楼2012-03-16 21:35:05
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普通回帖

木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-12-08 23:32:53:
1，如果是为了表达的话，引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基（在编码的氨基酸不变的情况下）,，这样可以使得引物的退火温度降低。

2，我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果还不错，70%+的GC ...

我现在用的GCbuffer1，您说的70%的GC什么意思？不是按说明书来的吗？
我用两步法（94变性，68复性延伸）作PCR可以看到目的片段条带，但是很淡他异性也很差，是不是说我普通PCR的时候可以把退火温度提高呢？
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3楼2011-12-09 17:04:27
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 木左左 at 2011-12-09 17:04:27:
我现在用的GCbuffer1，您说的70%的GC什么意思？不是按说明书来的吗？
我用两步法（94变性，68复性延伸）作PCR可以看到目的片段条带，但是很淡他异性也很差，是不是说我普通PCR的时候可以把退火温度提高呢？

我的意思是说我当初做的目的片段的GC含量是70%以上。是按照说明书来的，你可以把GC buffer 2 也买回来试试吧。

特异性不高不要紧的，只要能切胶回收到目的片段就OK了。一般来说提高退火温度会对特异性的提高有帮助。如果特异性太差的话你可以试试TD-PCR。
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5楼2011-12-09 18:13:25
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主的GC含量平均到多少？我们用的物种平均GC含量66%，用的Takara的LA-Taq+GC buffer1， 200bp到几k的片段都扩过，都没问题的，楼主可以试一下！
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木左左
jiayoubashaonian
6楼2011-12-09 19:09:12
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木左左

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-09 19:09:12:
楼主的GC含量平均到多少？我们用的物种平均GC含量66%，用的Takara的LA-Taq+GC buffer1， 200bp到几k的片段都扩过，都没问题的，楼主可以试一下！

我的gc含量和你们的差不多，都在65%左右
takara的LA-taq和GCbuffer1，片段都在2000bp左右，问题是一直不出结果，您能不能详细的说下你们是怎么做的，我用的CDNA为模板，植物籽粒提取RNA翻转的
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7楼2011-12-09 21:34:08
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 木左左 at 2011-12-09 21:34:08:
我的gc含量和你们的差不多，都在65%左右
takara的LA-taq和GCbuffer1，片段都在2000bp左右，问题是一直不出结果，您能不能详细的说下你们是怎么做的，我用的CDNA为模板，植物籽粒提取RNA翻转的

楼主是分段转录的还是一次反转录的？我们曾经拿到过3.123K ORF的cDNA采用的是分段转录，扩增后融合的方法。
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jiayoubashaonian
8楼2011-12-09 21:35:40
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木左左

银虫 (正式写手)
我们是一次转录的，不过现在是分段PCR目的基因，再酶切连接
2388ORF
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9楼2011-12-09 21:50:47
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