24小时热门版块排行榜    

查看: 4671  |  回复: 13
【悬赏金币】回答本帖问题,作者木左左将赠送您 56 个金币
本帖产生 2 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

木左左

银虫 (正式写手)

[求助] 高GC含量基因片段PCR问题

大家好,我现在克隆一组目的片段,以cDNA为模板,片段大小2kbp左右,GC含量均超过60%,实验做了2个多月,没有进展,很是苦恼
主要用的大连宝生物的la酶和GCbuffer
我在网上搜过,高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法,国外更多的是专利,我希望大家能帮帮我,他别是一下问题:
1.关于引物设计的问题,需要特别注意什么?
2.反应体系的问题,个组分的量,哪种酶效果好,额外的试剂?
3.程序问题,Tm值较高,是不是退火温度也可以比较高?变形温度用不用很高?
4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响?
如果哪位师兄师姐有这方面的经验或者是专利方面的信息业希望可以告诉我,小弟不胜感激,谢谢大家!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-12-08 23:32:53:
1,如果是为了表达的话,引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基(在编码的氨基酸不变的情况下),,这样可以使得引物的退火温度降低。

2,我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer,效果还不错,70%+的GC ...

我现在用的GCbuffer1,您说的70%的GC什么意思?不是按说明书来的吗?
我用两步法(94变性,68复性延伸)作PCR可以看到目的片段条带,但是很淡他异性也很差,是不是说我普通PCR的时候可以把退火温度提高呢?
3楼2011-12-09 17:04:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-09 19:09:12:
楼主的GC含量平均到多少?我们用的物种平均GC含量66%,用的Takara的LA-Taq+GC buffer1, 200bp到几k的片段都扩过,都没问题的,楼主可以试一下!

我的gc含量和你们的差不多,都在65%左右
takara的LA-taq和GCbuffer1,片段都在2000bp左右,问题是一直不出结果,您能不能详细的说下你们是怎么做的,我用的CDNA为模板,植物籽粒提取RNA翻转的
7楼2011-12-09 21:34:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木左左

银虫 (正式写手)

我们是一次转录的,不过现在是分段PCR目的基因,再酶切连接
2388ORF
9楼2011-12-09 21:50:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 木左左 的主题更新
不应助 确定回帖应助 (注意:应助才可能被奖励,但不允许灌水,必须填写15个字符以上)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] b口yq上会情况 +5 XUAAAAA 2024-06-19 6/300 2024-06-24 01:13 by sunrise3148
[考博] 对象没有,还非常想读博,难以抉择 +10 pvrw0224 2024-06-23 30/1500 2024-06-24 00:47 by pvrw0224
[基金申请] 厅级项目出校却没中 +3 Iwould 2024-06-23 3/150 2024-06-24 00:32 by MichaelBlunt
[基金申请] 国自然青年基金,1A4B能上会吗?青年和面上的上会标准是一样的吗? +19 今晚推荐22 2024-06-20 32/1600 2024-06-23 23:17 by andywei1028
[基金申请] 博后面上和特助今天出吗? +39 逗您玩 2024-06-21 75/3750 2024-06-23 21:37 by 悲催科研狗
[基金申请] 工材口青年基金上会可能性 +10 今晚推荐22 2024-06-19 13/650 2024-06-23 15:11 by Pickfoot
[硕博家园] 回家两天,不想呆了 +4 368ghnf 2024-06-22 4/200 2024-06-23 13:43 by lhjr123
[基金申请] 国产期刊影响因子大于12的有20多个个了 +17 babu2015 2024-06-20 22/1100 2024-06-23 13:12 by 德尚中行
[教师之家] 复旦夏同学提出高校成年人学生退学不应该让家长审核,大家认同吗? +8 苏东坡二世 2024-06-22 15/750 2024-06-22 21:37 by 我爱夏天了
[金属] EBSD的解析率只有10% +3 wallace6666 2024-06-20 6/300 2024-06-22 19:55 by EBSD
[有机交流] 三颈瓶加热 5+3 wzjwx888 2024-06-20 3/150 2024-06-22 16:38 by zyp0009928
[基金申请] 江南大学到瑞士招聘,称取消非升即走,改预聘+长聘 +24 babu2015 2024-06-18 29/1450 2024-06-22 16:29 by 风今25
[考博] 有机化学迷茫学生 +6 佛系摸鱼5 2024-06-18 11/550 2024-06-22 15:47 by yuanjijoy
[博后之家] 在国内某高校做全职博士后2年,现在找到新的单位,出站或退站对新工作有什么影响? +10 nxplfcc 2024-06-20 10/500 2024-06-22 07:52 by 徐长安
[有机交流] 锌粉还原反应 20+4 明宝栋 2024-06-17 6/300 2024-06-22 02:29 by hwalle
[基金申请] 面上博士后 +11 jsqy 2024-06-19 13/650 2024-06-21 17:12 by sizhouyi
[有机交流] 想要用氢化钠拔掉吲哚N上的氢取代酰氯 50+3 光敏剂 2024-06-19 4/200 2024-06-20 18:41 by HF111001
[论文投稿] 投稿求助 +4 平凡的日子 2024-06-19 5/250 2024-06-20 16:24 by yueyueyue@
[海外博后] 墨尔本大学博后offer要不要接 +3 kyxblmm 2024-06-18 3/150 2024-06-19 22:39 by blake1111
[基金申请] 博后基金刷到的BUG,图片来的更直观 +15 carolloo 2024-06-17 16/800 2024-06-19 09:42 by msjy
信息提示
请填处理意见