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brightfuture01

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【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金币+5): 非常感谢 2011-12-09 17:01:21
1,如果是为了表达的话,引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基(在编码的氨基酸不变的情况下),,这样可以使得引物的退火温度降低。

2,我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer,效果还不错,70%+的GC,有两种GC buffer A 和B,如果A不行的话试试B。

3,Tm高的话,退火温度可以适当设置高一些。变性也可以比95度高那么几度。

4, 这个问题我回答不了。

我的一点建议: 如果PCR产物很弱的话,可以做个胶回收,连T,然后让其在质粒里面复制从而获得大量的目的基因片段。

PCR不一定非要使用公司的GCbuffer,可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。60%应该不是很难扩增的。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-12-08 23:32:53
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【答案】应助回帖

mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金币+5): 非常感谢,不知道您能不能告知联系方式,我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
这个问题我在国外的时候也碰到过,当时我扩增一个基因的promoter区,GC含量70%以上,后来解决了:
方法1. 巢式PCR,在目的片段的两端非高GC含量区设计引物,比如可以扩增2500到3000 bp,然后以此为模板进行第二次PCR。
方法2. 换酶,我用过ABI的gold 360,附带GC buffer,效果非常不错。提醒一下,GC buffer的用量要摸索。
你的问题答复如下:

我在网上搜过,高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法,国外更多的是专利,我希望大家能帮帮我,他别是一下问题:
1.关于引物设计的问题,需要特别注意什么?
> 我用Primer3Plus设计引物,效果非常好。引物设计的注意事项较多,在这里关键不要在3‘末端有连续的G或C。
2.反应体系的问题,个组分的量,哪种酶效果好,额外的试剂?
> ABI的金牌360,额外的GC buffer。
3.程序问题,Tm值较高,是不是退火温度也可以比较高?变形温度用不用很高?
> 退火温度最高在63或65度,再高也没有好处。
  根据酶的不同,变性温度可以在95度5到10分钟。
4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响?
> 一般启动子区域或遗传印记区域GC含量较高,
  本人博士毕业后在国外做博士后几年,目前在上海一著名大学任教授,具有多年的分子生物学经验
请相信坚持的力量
4楼2011-12-09 17:45:42
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