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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金币+5): 非常感谢 2011-12-09 17:01:21

1，如果是为了表达的话，引物设计时候可以将一部分GC变成其他碱基（在编码的氨基酸不变的情况下）,，这样可以使得引物的退火温度降低。

2，我当初做GC的时候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果还不错，70%+的GC，有两种GC buffer A 和B，如果A不行的话试试B。

3，Tm高的话，退火温度可以适当设置高一些。变性也可以比95度高那么几度。

4，这个问题我回答不了。

我的一点建议：如果PCR产物很弱的话，可以做个胶回收，连T，然后让其在质粒里面复制从而获得大量的目的基因片段。

PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。60%应该不是很难扩增的。

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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.

2楼2011-12-08 23:32:53

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【答案】应助回帖

mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41

这个问题我在国外的时候也碰到过，当时我扩增一个基因的promoter区，GC含量70%以上，后来解决了：
方法1. 巢式PCR，在目的片段的两端非高GC含量区设计引物，比如可以扩增2500到3000 bp，然后以此为模板进行第二次PCR。
方法2. 换酶，我用过ABI的gold 360，附带GC buffer，效果非常不错。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。
你的问题答复如下：

我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题：
1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？
> 我用Primer3Plus设计引物，效果非常好。引物设计的注意事项较多，在这里关键不要在3‘末端有连续的G或C。
2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？
> ABI的金牌360，额外的GC buffer。
3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？
> 退火温度最高在63或65度，再高也没有好处。
根据酶的不同，变性温度可以在95度5到10分钟。
4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？
> 一般启动子区域或遗传印记区域GC含量较高，
本人博士毕业后在国外做博士后几年，目前在上海一著名大学任教授，具有多年的分子生物学经验

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请相信坚持的力量

4楼2011-12-09 17:45:42

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