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木左左银虫 (正式写手)
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[求助]
高GC含量基因片段PCR问题
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大家好，我现在克隆一组目的片段，以cDNA为模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超过60%，实验做了2个多月，没有进展，很是苦恼 主要用的大连宝生物的la酶和GCbuffer 我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题： 1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？ 2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？ 3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？ 4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？ 如果哪位师兄师姐有这方面的经验或者是专利方面的信息业希望可以告诉我，小弟不胜感激，谢谢大家！ |
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luckyhongli
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【答案】应助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
木左左(金币+5): 非常感谢，不知道您能不能告知联系方式，我好继续向您请教 2011-12-09 21:40:41
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这个问题我在国外的时候也碰到过，当时我扩增一个基因的promoter区，GC含量70%以上，后来解决了： 方法1. 巢式PCR，在目的片段的两端非高GC含量区设计引物，比如可以扩增2500到3000 bp，然后以此为模板进行第二次PCR。 方法2. 换酶，我用过ABI的gold 360，附带GC buffer，效果非常不错。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。 你的问题答复如下： 我在网上搜过，高GC含量片段国内肯定很多学校有成熟的方法，国外更多的是专利，我希望大家能帮帮我，他别是一下问题： 1.关于引物设计的问题，需要特别注意什么？ > 我用Primer3Plus设计引物，效果非常好。引物设计的注意事项较多，在这里关键不要在3‘末端有连续的G或C。 2.反应体系的问题，个组分的量，哪种酶效果好，额外的试剂？ > ABI的金牌360，额外的GC buffer。 3.程序问题，Tm值较高，是不是退火温度也可以比较高？变形温度用不用很高？ > 退火温度最高在63或65度，再高也没有好处。 根据酶的不同，变性温度可以在95度5到10分钟。 4.比较高的GC含量到底对基因的结构有什么影响？ > 一般启动子区域或遗传印记区域GC含量较高， 本人博士毕业后在国外做博士后几年，目前在上海一著名大学任教授，具有多年的分子生物学经验 |
4楼2011-12-09 17:45:42
luckyhongli
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10楼2011-12-10 14:50:22
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11楼2011-12-10 15:32:28
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