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tianhuijuan

金虫 (小有名气)

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[求助] nest-PCR引物设计的问题

如题。nest-PCR，模板：猪肝中提取RNA，反转录成cDNA, DNA双链补平后与复性的marathon 16℃过夜连接。其中DNA双链经之前成功的引物验证过有条带。手动设计的引物如下：
外侧引物：
thjAP1（f） 5′-CCATCCTAATACGACTCAC-3′
primer A (r)  5′-CAC CAT TgT CAA Tgg TgA gA-3′
内侧引物：
thjAP2(f)  5′-GGCCGGATCCTATAGGGCTCGAGCGGC-3′
primer B(r)  5′-CCg CCg CTC gAg Tgg TAC AgT AAC AAC TgC AT-3′
循环条件：
Stage 1 Step 1 95℃ 5 min    ×1 cycle
Stage 2 Step 1 93℃ 40 sec
Step 2 56℃ 60 sec    ×  29 cycles
Step 3 72℃ 60 sec
Stage 3 Step 1 93℃ 40 sec
Step 2 56℃ 60 sec    ×1 cycle
Step 3 72℃ 20 min
Hold at 12℃
其中，退火温度和延伸时间都做过调整，均没有改善，都是只有引物间的二聚体。
请教高手虫友们，引物是否存在问题，亦或是其它的问题呢？

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1楼 2011-12-07 10:59:29

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