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tianhuijuan金虫 (小有名气)
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[求助]
nest-PCR引物设计的问题
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如题。nest-PCR，模板：猪肝中提取RNA，反转录成cDNA, DNA双链补平后与复性的marathon 16℃过夜连接。其中DNA双链经之前成功的引物验证过有条带。手动设计的引物如下： 外侧引物： thjAP1（f） 5′-CCATCCTAATACGACTCAC-3′ primer A (r) 5′-CAC CAT TgT CAA Tgg TgA gA-3′ 内侧引物： thjAP2(f) 5′-GGCCGGATCCTATAGGGCTCGAGCGGC-3′ primer B(r) 5′-CCg CCg CTC gAg Tgg TAC AgT AAC AAC TgC AT-3′ 循环条件： Stage 1 Step 1 95℃ 5 min ×1 cycle Stage 2 Step 1 93℃ 40 sec Step 2 56℃ 60 sec × 29 cycles Step 3 72℃ 60 sec Stage 3 Step 1 93℃ 40 sec Step 2 56℃ 60 sec ×1 cycle Step 3 72℃ 20 min Hold at 12℃ 其中，退火温度和延伸时间都做过调整，均没有改善，都是只有引物间的二聚体。 请教高手虫友们，引物是否存在问题，亦或是其它的问题呢？ |
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