应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » nest-PCR引物设计的问题
11/1返回列表
查看: 1218  |  回复: 0
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

tianhuijuan

金虫 (小有名气)

[求助] nest-PCR引物设计的问题

如题。nest-PCR，模板：猪肝中提取RNA，反转录成cDNA, DNA双链补平后与复性的marathon 16℃过夜连接。其中DNA双链经之前成功的引物验证过有条带。手动设计的引物如下：
外侧引物：
thjAP1（f） 5′-CCATCCTAATACGACTCAC-3′
primer A (r)  5′-CAC CAT TgT CAA Tgg TgA gA-3′
内侧引物：
thjAP2(f)  5′-GGCCGGATCCTATAGGGCTCGAGCGGC-3′
primer B(r)  5′-CCg CCg CTC gAg Tgg TAC AgT AAC AAC TgC AT-3′
循环条件：
Stage 1        Step 1        95℃        5 min       ×1 cycle
Stage 2        Step 1        93℃        40 sec
        Step 2        56℃        60 sec     ×  29 cycles
        Step 3        72℃        60 sec
Stage 3        Step 1        93℃        40 sec
        Step 2        56℃        60 sec     ×1 cycle
        Step 3        72℃        20 min
Hold at 12℃
其中，退火温度和延伸时间都做过调整，均没有改善，都是只有引物间的二聚体。
请教高手虫友们，引物是否存在问题，亦或是其它的问题呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-12-07 10:59:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~

科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
相关版块跳转 我要订阅楼主 tianhuijuan 的主题更新
11/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭