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juneinsect

新虫 (初入文坛)

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[求助] 【求助】AFLP选扩片段太大，酶切不彻底

各位师兄师姐，我做蚯蚓AFLP，最近碰到一些问题想请大家指教。下面三张胶图，图1，图2，图3分别是我做gDNA酶切，预扩增，选扩增（筛引物）的图片。图1图2（酶切和预扩增）的maker是MakerI，图3（选扩增）的maker是maker100bp plus。我的困惑是，请各位大侠看看我的酶切是否已经完全？为何选扩增片段会这么大？选扩增片段在多少为宜？要想选扩增片段变小应该采取什么改进措施呢？
我用的内切酶组合分别是：EcoRI+MseI，EcoRI+MspI，EcoRI+HpaII。MspI和HpaII的酶切位点都是GGCC。

图1
图1从左到右分别是：EcoRI+MseI双酶切，EcoRI+MspI双酶切，EcoRI+HpaII双酶切，gDNA，MakerI
用的NEB的酶，酶切时间3h，Buffer分别用的是NEB4，NEB4，NEB1。另外，想解释一下，600bp左右的亮条带应该是RNA。
[img]http://img.dxycdn.com/upload/2011/12/03/32/98405763.snap.jpg[/url][/img]图2
预扩增条件：94℃ 30S， 56℃ 1min， 72℃ 1min，21个循环。
跑胶条件：琼脂糖浓度2%,100V，20min
我感觉扩增最亮的片段在300bp-400bp之间。

图3选扩增条件：94℃ 30S， 65℃ 1min， 72℃ 1min，12个循环，每个循环退火温度下降0.7℃；94℃ 30S， 56℃ 1min， 72℃ 1min，23个循环. 跑胶条件：琼脂糖浓度4%,80V，1h
请问各位高手，琼脂糖跑出来这样的选扩产物能否做PAGE电泳了？

我的困惑是，请各位大侠看看我的各个步骤都有什么问题，特别是酶切是否完全？为何选扩增片段会这么大？选扩增片段在多少为宜？要想选扩增片段变小应该采取什么改进措施呢？
另外还想请教各位，选扩产物做测序胶电泳好还是跑测序仪好，哪里可以做这样的服务呢？

[ Last edited by juneinsect on 2011-12-7 at 10:11 ]

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