应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 枯草杆菌 电转化
51/1返回列表
查看: 3617  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)

[求助] 枯草杆菌 电转化 已有1人参与

最近做试验又出状况了：

需要往枯草杆菌WB800N里转一个质粒，大概9000bp多，但现在我做每次都能转进去，就是转化效率很低，但我需要很高的转化效率，所以再次求助各位高人了：
枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法）转化   

1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.5ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。

4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。

5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装60。

6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。

电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）

7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2

200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，10%甘油。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
阳光倾城！
1楼 2011-11-18 12:13:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xissy at 2014-02-27 22:01:01
您好，关于2步法我查了一下有好多文献，方法都略有差异。请问您具体是用什么方法呢？
这个是我查的一个貌似比较好用的方法。

1、划线。
2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
3、次日 ...

就是这个，关键是你要摸好溶液I摇菌的时间，OD600为0.85-0.95.
赞一下 回复此楼
7楼2014-02-27 22:02:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

银杏酸酸

银虫 (小有名气)
请问你是怎么做的啊，我一直都做不出来。
赞一下 回复此楼
2楼2014-01-10 17:28:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xissy

铜虫 (小有名气)
请问一下，你这3个培养基都需要测pH吗？还是第一个需要pH7.2。另外，我听说电转对培养基的纯度要求很高，水啊，试剂啊等等。请问，你的这些试剂是什么厂家的，能分享下吗？水是去离子水，还是更高要求的ddH2O呢？
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-11 13:33:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xissy at 2014-02-11 13:33:39
请问一下，你这3个培养基都需要测pH吗？还是第一个需要pH7.2。另外，我听说电转对培养基的纯度要求很高，水啊，试剂啊等等。请问，你的这些试剂是什么厂家的，能分享下吗？水是去离子水，还是更高要求的ddH2O呢？

试剂是sigma，培养基都要精确pH，去离子水即可。
赞一下 回复此楼
阳光倾城！
4楼2014-02-14 10:17:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +22 yaoyewhu2008 2026-08-20 23/1150 2026-08-21 07:19 by sincosx
[基金申请] 基金啊基金 +3 longfie172 2026-08-20 3/150 2026-08-21 00:04 by wuchongjun
[基金申请] 科研孤儿太难了 +14 我4大白菜 2026-08-20 15/750 2026-08-20 22:33 by 袁向阳007
[基金申请] 言之凿凿，明天官网会通知放榜？ +15 医学老男孩 2026-08-20 17/850 2026-08-20 20:35 by CaoLG
[基金申请] 时间戳又变了 +12 wuchongjun 2026-08-20 17/850 2026-08-20 20:05 by spzhao
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭