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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 枯草杆菌 电转化
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Ag6501

金虫 (正式写手)

[求助] 枯草杆菌 电转化 已有1人参与

最近做试验又出状况了：

需要往枯草杆菌WB800N里转一个质粒，大概9000bp多，但现在我做每次都能转进去，就是转化效率很低，但我需要很高的转化效率，所以再次求助各位高人了：
枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法）转化   

1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.5ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。

4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。

5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装60。

6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。

电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）

7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2

200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，10%甘油。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。
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阳光倾城！
1楼 2011-11-18 12:13:00
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银杏酸酸

银虫 (小有名气)
请问你是怎么做的啊，我一直都做不出来。
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2楼2014-01-10 17:28:28
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xissy

铜虫 (小有名气)
请问一下，你这3个培养基都需要测pH吗？还是第一个需要pH7.2。另外，我听说电转对培养基的纯度要求很高，水啊，试剂啊等等。请问，你的这些试剂是什么厂家的，能分享下吗？水是去离子水，还是更高要求的ddH2O呢？
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3楼2014-02-11 13:33:39
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Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xissy at 2014-02-11 13:33:39
请问一下，你这3个培养基都需要测pH吗？还是第一个需要pH7.2。另外，我听说电转对培养基的纯度要求很高，水啊，试剂啊等等。请问，你的这些试剂是什么厂家的，能分享下吗？水是去离子水，还是更高要求的ddH2O呢？

试剂是sigma，培养基都要精确pH，去离子水即可。
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阳光倾城！
4楼2014-02-14 10:17:50
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不用纠结了。。。一般都是这样的。。。你现在想要建库吗？有两种选择。1 多做几次，把质粒浓度调整好浓。多涂板即可。其实两步法很好做啊。你的质粒和我的差不多。 2更换体系，用张晓舟博士的多聚体加上超级感受态SCK6。
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5楼2014-02-14 21:21:45
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-02-14 21:21:45
不用纠结了。。。一般都是这样的。。。你现在想要建库吗？有两种选择。1 多做几次，把质粒浓度调整好浓。多涂板即可。其实两步法很好做啊。你的质粒和我的差不多。 2更换体系，用张晓舟博士的多聚体加上超级感受态S ...

您好，关于2步法我查了一下有好多文献，方法都略有差异。请问您具体是用什么方法呢？
这个是我查的一个貌似比较好用的方法。

1、划线。
2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
3、次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。
4、再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃慢摇床培养90分钟，离心收集菌体。
5、用10ml原培养液上清液悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞，可以直接用于转化；也可以加30%的灭菌甘油至终浓度10%，混匀后分装到离心管中（0.5ml/Tube），随即放到-70℃保存。
6、转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量DNA（1ug/ml）。
7、于37℃缓慢振荡（80rpm）培养，分别培养30min、45min、60min、75min、90min后，取100μl培养液涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
【培养基配方】
1.10×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至100ml。
2.L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。
3.GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。
4.GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。
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6楼2014-02-27 22:01:01
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xissy at 2014-02-27 22:01:01
您好，关于2步法我查了一下有好多文献，方法都略有差异。请问您具体是用什么方法呢？
这个是我查的一个貌似比较好用的方法。

1、划线。
2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
3、次日 ...

就是这个，关键是你要摸好溶液I摇菌的时间，OD600为0.85-0.95.
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7楼2014-02-27 22:02:13
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-02-27 22:02:13
就是这个，关键是你要摸好溶液I摇菌的时间，OD600为0.85-0.95....

请问一下，我想确定一下，是GM I的浓度OD600=0.85-0.95，而GM II 的时间就是固定的90min吗？另外酵母汁是不是就是酵母溶于水啊?
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8楼2014-02-27 22:06:58
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xissy at 2014-02-27 22:06:58
请问一下，我想确定一下，是GM I的浓度OD600=0.85-0.95，而GM II 的时间就是固定的90min吗？另外酵母汁是不是就是酵母溶于水啊?...

恩恩，酵母膏啊。。。当然不是酵母溶于水，你这样会污染的。你可以详细查查培养基配方。
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9楼2014-02-27 22:09:52
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-02-27 22:09:52
恩恩，酵母膏啊。。。当然不是酵母溶于水，你这样会污染的。你可以详细查查培养基配方。...

哦~谢谢。另外，如果我要做WB800的两步法，也是添加L- trp吗？
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10楼2014-02-27 22:11:51
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