24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Ag6501

金虫 (正式写手)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 1719.7
散金: 28
红花: 2
帖子: 314
在线: 203.1小时
虫号: 629498
注册: 2008-10-18
性别: MM
专业: 环境微生物学

[求助] 枯草杆菌电转化已有1人参与

最近做试验又出状况了：

需要往枯草杆菌WB800N里转一个质粒，大概9000bp多，但现在我做每次都能转进去，就是转化效率很低，但我需要很高的转化效率，所以再次求助各位高人了：
枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法）转化

1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。

2）取2.5ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95.

3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。

4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。

5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装60。

6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。

电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）

7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2

200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，10%甘油。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

阳光倾城！

1楼 2011-11-18 12:13:00

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)

应助: 73 (初中生)
金币: 1727.8
散金: 20
红花: 2
帖子: 201
在线: 210.1小时
虫号: 953497
注册: 2010-02-07
专业: 微生物资源与分类学

【答案】应助回帖

不用纠结了。。。一般都是这样的。。。你现在想要建库吗？有两种选择。1 多做几次，把质粒浓度调整好浓。多涂板即可。其实两步法很好做啊。你的质粒和我的差不多。 2更换体系，用张晓舟博士的多聚体加上超级感受态SCK6。

赞一下

回复此楼

5楼2014-02-14 21:21:45

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)

应助: 73 (初中生)
金币: 1727.8
散金: 20
红花: 2
帖子: 201
在线: 210.1小时
虫号: 953497
注册: 2010-02-07
专业: 微生物资源与分类学

引用回帖:

6楼: Originally posted by xissy at 2014-02-27 22:01:01
您好，关于2步法我查了一下有好多文献，方法都略有差异。请问您具体是用什么方法呢？
这个是我查的一个貌似比较好用的方法。

1、划线。
2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
3、次日 ...

就是这个，关键是你要摸好溶液I摇菌的时间，OD600为0.85-0.95.

赞一下

回复此楼

7楼2014-02-27 22:02:13

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖