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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请做过westernblot实验的战友前来赐教
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2011加油

银虫 (正式写手)

[交流] 请做过westernblot实验的战友前来赐教

最近我在做westernblot实验，遇到一些问题，特发此贴，以求指导。
1、由于我提的是核蛋白，浓度很低，上样体积受到梳子孔径的限制，所以蛋白的上样量只有几个微克左右。现在要问的是，大家提取核蛋白，种细胞时，是采用6孔板还是培养皿种板呢？

2、在进行ECL发光实验时，发现膜上有荧光，但压片曝光后，发现胶片上只有膜的黑印记，却无任何条带，求解释？？

望大家不吝赐教，非常感谢！
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1楼 2011-10-22 09:36:45
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hf2016

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢回答 2011-10-22 10:42:46
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-22 15:26:08
我们用的培养瓶为了增加上样量都用五乘

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2011-10-22 10:40:14
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青豆同学

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢，希望继续多帮忙分析。 2011-10-22 14:28:04
曝光时间长了吧？
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3楼2011-10-22 13:15:59
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青豆同学 at 2011-10-22 13:15:59:
曝光时间长了吧？

大概2-3min，这应该不算久啊。
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5楼2011-10-22 14:26:00
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青豆同学

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+2): 这是经验！ 2011-10-23 11:05:54
2011加油(金币+1): 谢谢回答 2011-10-23 20:49:41
2011加油(金币+1): 2011-12-26 22:19:55
引用回帖:
5楼: Originally posted by 2011加油 at 2011-10-22 14:26:00:
大概2-3min，这应该不算久啊。

我这边一般都是曝光10秒左右，黑乎乎的一片，应该是跟曝光时间有关
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7楼2011-10-23 10:08:25
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 青豆同学 at 2011-10-23 10:08:25:
我这边一般都是曝光10秒左右，黑乎乎的一片，应该是跟曝光时间有关

哦，请问你的蛋白上样量是多少，分子量大小及转膜条件？
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8楼2011-10-23 12:50:32
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btx362237729

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢啊 2011-10-25 19:09:45
5Xloading buffer会有所帮助
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10楼2011-10-23 18:08:34
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jakelly

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢回答啊 2011-10-23 20:30:41
2011加油(金币+1): 2011-12-26 22:18:49
用宽的梳子做样品孔可以增加上样量，条带的问题很可能是暴光时间太长。我们一般压10秒左右，最多一两分钟。
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12楼2011-10-23 19:20:07
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by jakelly at 2011-10-23 19:20:07:
用宽的梳子做样品孔可以增加上样量，条带的问题很可能是暴光时间太长。我们一般压10秒左右，最多一两分钟。

这位朋友你好，我想问一下，即使没看到荧光的情况下，曝光时间也是这么短？？？
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13楼2011-10-23 20:28:29
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by btx362237729 at 2011-10-23 18:08:34:
5Xloading buffer会有所帮助

热变性蛋白前，每次都用到了。
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14楼2011-10-23 20:51:02
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dongxiaomin

银虫 (小有名气)
★
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2011加油(金币+1): 谢谢啊 2011-10-23 22:14:40
首先可一选用大孔径的梳子来增加上样量，其次可以减少Loadingbuffer的体积;检查显影试剂有没有问题
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15楼2011-10-23 21:42:16
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青豆同学

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢支持 2011-11-09 22:20:25
引用回帖:
8楼: Originally posted by 2011加油 at 2011-10-23 12:50:32:
哦，请问你的蛋白上样量是多少，分子量大小及转膜条件？

我明天去给你问问，我不做这方面的，但跟着参观过，我同事做
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16楼2011-10-23 22:41:14
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jakelly

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢啊 2011-10-24 08:17:34
引用回帖:
13楼: Originally posted by 2011加油 at 2011-10-23 20:28:29:
这位朋友你好，我想问一下，即使没看到荧光的情况下，曝光时间也是这么短？？？

我们如果看不到荧光，就压一两分钟，应该就能出来，要不就可没有条带了，需要改变别的条件。你们用的ECL是什么公司的？我们用的加强型的Pierce的。
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17楼2011-10-24 00:35:13
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by jakelly at 2011-10-24 00:35:13:
我们如果看不到荧光，就压一两分钟，应该就能出来，要不就可没有条带了，需要改变别的条件。你们用的ECL是什么公司的？我们用的加强型的Pierce的。

我看到瓶子上也有pierce字样。
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18楼2011-10-24 08:20:52
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frank213

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 好的，谢谢您的建议 2011-10-24 08:34:46
是啊，缓冲液调整，曝光时间调整
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19楼2011-10-24 08:33:16
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wxq999

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜:编辑内容 2011-10-24 17:48
-------------广告内容-----------------
该虫多次发布广告，为了避免版主刷管理记录的嫌疑，不再每个帖子单独扣分，而是分几次重罚。请自重，勿扰乱论坛的正常交流！

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-24 at 17:48 ]
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20楼2011-10-24 17:02:59
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loveerobin

木虫 (职业作家)
2011加油(金币+1): 谢谢你 2011-10-24 19:59:57
我也出现过类似的情况
多重复两次
加油
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21楼2011-10-24 18:14:46
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by loveerobin at 2011-10-24 18:14:46:
我也出现过类似的情况
多重复两次
加油

会的，这个实验还在继续，仍在调整和排查一些因素，希望下次做的结果好一些
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22楼2011-10-24 19:51:57
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
2011加油(金币+1): 谢谢回答 2011-10-26 08:15:57
我们压过的最短曝光时间是5s。。。
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23楼2011-10-25 20:38:06
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简单回复
大轰炸4楼
2011-10-22 14:08   回复  
2011加油(金币+1): 谢谢顶贴 2011-11-09 13:47:09
2011加油6楼
2011-10-22 19:39   回复  
mlanqiang9楼
2011-10-23 14:22   回复  
2011加油(金币+1): 谢谢顶帖 2011-11-09 13:47:32
2011加油11楼
2011-10-23 18:39   回复  
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