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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于PCR退火温度
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hgq115

金虫 (小有名气)

[交流] 关于PCR退火温度

PCR引物设计的时候，用不同的软件设计会发现同一个引物的Tm值相差比较大，与用4（G+C）*2(A+T)获得的结果也不同。请问各位虫友在设计的时候是如何确定引物的Tm值的？
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1楼2011-10-20 09:47:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hgq115(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流！55王道~ 2011-10-21 08:55:03
跑PCR的时候一律55度的飘过....
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4楼2011-10-20 11:30:06
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liuhedong1817

木虫 (正式写手)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
hgq115(金币+4): 2011-10-20 14:15:53
adslye(BioEPI+1): 对的，就是这个道理。只是公式不同，无对错之分。 2011-10-21 08:55:44
根据查找的文献发现，计算Tm值的至少有20几个公式，而且也没有通用的公式，但是大多数相差都在10℃范围内。所以，只要你根据引物合成公司提供的Tm值，然后根据Tm+5，Tm-5这个数值范围，做一个退火温度梯度，然后根据PCR的条带浓度大小，就可以得到较准确的退火温度了。
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6楼2011-10-20 12:33:31
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普通回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hgq115(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流，TM计算公式不同而已，没有对错。 2011-10-21 08:54:35
利用软件引物，实际Tm值以公司的报告为准。
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2楼2011-10-20 09:50:22
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sunqinyan

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
hgq115(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-21 08:54:45
primer 5.0设计的时候就会给
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3楼2011-10-20 10:38:27
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wuushu

金虫 (正式写手)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
引物合成回来，单子上有写Tm值
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8楼2011-10-20 15:20:05
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fisheart

金虫 (小有名气)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
设计时正反引物TM值范围尽量一致就可以了，公司返回的测序单会提供准确的
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9楼2011-10-20 15:40:13
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sptm1019

银虫 (小有名气)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
都是55做的
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10楼2011-10-20 16:26:22
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
hgq115(金币+4): 2011-10-20 18:06:26
设计引物时Tm 值以软件计算值为参考，不要太高或太低就行，实际合成引物后，由于离子浓度的不同，导致退火温度有所改变，以公司引物合成报告单为参考，上下浮动5℃的值都可以P。可以通过梯度PCR决定最合适的退火温度。
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11楼2011-10-20 16:52:11
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第五平原

木虫 (正式写手)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
顶4楼，我也是55度，哈哈。
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12楼2011-10-20 22:53:42
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zoelxx

铁杆木虫 (正式写手)
★
hgq115(金币+1):谢谢参与
只要同一软件算出来的上下游引物Tm值差距不太大，然后引物来了可以适当的在Tm值上下5度范围内pcr试一下，就行了
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13楼2011-10-21 10:00:06
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hgq115

金虫 (小有名气)
谁知道引物3'端包含几个碱基吗？
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14楼2011-10-21 12:58:54
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youngker918

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
不管是软件还是引物公司都是根据一定的算法算出来的，没有严格的对错之分。建议楼主在新引物来的时候做一锅梯度退火温度试一下
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15楼2011-10-21 14:51:17
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suzy150

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
先通过软件设计引物 实验中的退火温度用软件中显示的Tm值-5度 若P不出来 就做温度梯度 一般50-70度就可以了
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17楼2011-10-21 17:33:33
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zhen_fang

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
公司会给你具体的单子，上面一般有温度吧，正负5上下，一切OK
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18楼2011-10-21 17:45:39
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clarktao5楼
2011-10-20 12:08   回复  
hgq115(金币+1):谢谢参与
haoqi0077楼
2011-10-20 12:48   回复  
hgq115(金币+1):谢谢参与
liuxiuaza16楼
2011-10-21 15:56   回复  
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