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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 提取土壤DNA，如何去除腐殖质等PCR抑制物？
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1楼 2011-10-18 14:58:54
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老夏853

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★
zhang8826857(金币+1): 鼓励鼓励 2011-10-19 10:07:48
引用回帖:
9楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-18 18:40:49:
这个方法我正在用呢。。。。一般来说，10000 rpm X 5-10min 会把所有的微生物菌体或菌丝体都离心下来的。。对于提取土壤中微生物胞内的DNA没有任何损失。

除非你提取的就是。。。土壤中游离出来的DNA   

好吧 可是我还有两个疑问
1  第二步自然沉淀土壤颗粒，一般来说颗粒里面包裹着的微生物数量也不少 ，取上清损失应该是有的
2 你说腐植酸 选择性溶解或者沉淀 那说明 腐植酸可溶部分还是去不掉的  


我声明一下， 我没有挑你刺  只是探讨一下，不要误会。‘
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11楼2011-10-18 18:47:33
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HarveyWang

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★ ★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金币+3): 鼓励 2011-10-18 16:28:50
wolfebst(金币+3): 鼓励 2011-10-18 16:28:52
lilylee61(金币+1): 你提供的方法我有待验证，希望有用。多谢你的指教。 2011-10-19 19:54:39
很简单。。

1）在进行上述操作之前，将土壤样品在 0.9% NaCl 灭菌水中混匀2-5 min（1g 土壤/5-10mL），然后高速离心10000 rpm X 5min，使土壤颗粒和菌体或菌丝沉淀。

2）倒掉离心上清！将沉淀用1-3 mL 0.9% NaCl 灭菌水重悬，冰浴中静置1-2分钟使土壤颗粒自然沉淀。

3）取浑浊的上层液1-2 mL，高速离心10000 rpm X 5-10min。倒掉离心上清！沉淀再按比例加入DNA提取缓冲液和石英砂等，进行提取工作（这个比例得根据你自己的土壤样品摸索下咯）。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
2楼2011-10-18 16:00:24
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3楼2011-10-18 16:11:22
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HarveyWang

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★
zhang8826857(金币+1): 鼓励一下^_^ 2011-10-18 17:20:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by lilylee61 at 2011-10-18 16:11:22:
0.9% NaCl 灭菌水 是用于清除腐殖质的吗？

用于悬浮和沉淀菌体。。。。腐殖质的大部分都可以选择性地在上清（可溶性部分）或与土壤共沉与沉淀中（残枝败叶）。
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4楼2011-10-18 16:37:36
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-18 16:00:24:
很简单。。

1）在进行上述操作之前，将土壤样品在 0.9% NaCl 灭菌水中混匀2-5 min（1g 土壤/5-10mL），然后高速离心10000 rpm X 5min，使土壤颗粒和菌体或菌丝沉淀。

2）倒掉离心上清！将沉淀用1-3 mL 0.9% ...

您好！
目前我看到的关于这方面土壤DNA 提取 腐植酸去除 是个很大的难题 你这个办法不知道你亲自用过没？ 另外，如果分离菌体跟腐殖质效果好的话，那一般做土壤DNA的 一般是做微生物多样性的 这样的方法损失率该有多大呢？
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5楼2011-10-18 18:11:55
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老夏853

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★ ★ ★
amisking(金币+3, MicEPI+1): 鼓励发帖交流！ 2011-10-18 21:51:25
引用回帖:
1楼: Originally posted by lilylee61 at 2011-10-18 14:58:54:
大致方法是：
加入DNA提取缓冲液、石英砂，震荡混匀
加入溶菌酶、37摄氏度摇床
加入SDS溶液，水浴30min
液氮、75℃水浴反复冻融
离心取上清
加入NaCl/CTAB溶液和氯仿-异戊醇，离心去上清，重复抽提2次
取上 ...

PCR 扩不出来 可以参考以下
1 稀释模板10到50倍或者更大
2 加保护剂 BSA 二甲基亚砜等
3 试试TD pcr 效果应该能好一点
4 再就是你要确定土壤DNA 里面有你要扩的东西 如果引物针对性很强的  不DNA 中不一定有。 从你提取DNA  的方法 看样子是做细菌的  扩的不会是16S 吧 ？
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6楼2011-10-18 18:16:27
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匿名

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7楼2011-10-18 18:33:52
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老夏853

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★ ★
zhang8826857(金币+2): 真热心啊，呵呵 2011-10-19 10:07:01
引用回帖:
7楼: Originally posted by lilylee61 at 2011-10-18 18:33:52:
4 我是在土壤中加入不同浓度的真菌孢子，用该真菌的特异性引物扩的。
BSA加过，也扩不出。

这个 我们实验室也有人做
你看看真菌提取方法
试用尿素提取液 蜗牛酶破壁等方法针对真菌来优化一下提取方法
另外 最好前面加一步液氮研磨。
我估计极有可能是孢子没有破开
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8楼2011-10-18 18:37:26
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HarveyWang

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★ ★
zhang8826857(金币+2): 鼓励交流 2011-10-19 10:07:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-10-18 18:11:55:
您好！
目前我看到的关于这方面土壤DNA 提取 腐植酸去除 是个很大的难题 你这个办法不知道你亲自用过没？ 另外，如果分离菌体跟腐殖质效果好的话，那一般做土壤DNA的 一般是做微生物多样性的 这样的方法损失率该 ...

这个方法我正在用呢。。。。一般来说，10000 rpm X 5-10min 会把所有的微生物菌体或菌丝体都离心下来的。。对于提取土壤中微生物胞内的DNA没有任何损失。

除非你提取的就是。。。土壤中游离出来的DNA   
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9楼2011-10-18 18:40:49
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HarveyWang

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另外，楼上的兄弟说得对，你要注意破碎的效率。。。液氮研磨或往复式细胞破碎。你可以用哪种土壤DNA提取试剂盒。。。里面就有破碎用给石英砂啊。
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10楼2011-10-18 18:43:41
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