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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于质粒的构建
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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] 关于质粒的构建

小弟最近在做表达质粒的构建，由于目的片段较长（2700bp），根据载体上的酶切位点，将其分为四段，分别构建好之后，在逐一将其连接上。

遇到的问题：单独四个质粒构建好了，但是两两相互连接的时候却一直连接不上。（用NEB的T4连接酶10微升体系），求高手指点！！
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好好生活，努力赚钱
1楼 2011-10-12 18:23:06
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

amisking: 2011-10-12 20:59:57
这个确实比较棘手一些。。。
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-10-12 20:23:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2011-10-12 21:00:02
2.7 K，不算很长啊，完全可以一次连上去的，为什么要分几次，还是4次，工作量不是大了很多。
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Thank-you，so-blue.
3楼2011-10-12 20:48:46
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ruth_3912834

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是啊，我也觉得没必要分成四段，我们有6K的都直接构建。
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4楼2011-10-12 20:53:40
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-13 10:34:10
这个构建策略是你自己设计的，还是你的老板或者师兄师姐设计的？抑或你不仅仅是要将2.7K的片段连接到一个载体上去？
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致良知
5楼2011-10-12 22:19:39
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l-c-l

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

直接买罗氏的一种高保真酶，扩增两千多不会突变，大概一千多一支，效果真不错。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2011-10-12 23:17:02
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-13 10:23:36
2.7 K，一点也不长啊，完全可以一次连上去的，6.8KB的我都做过，一次连，很方便的呀
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7楼2011-10-12 23:21:44
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guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-13 10:34:18
没必要分4个吧。。。直接连吧你。连接时间加长试试？
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8楼2011-10-13 10:02:34
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weiwei_he

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以直接连的，你试试看
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nopains,nogains
9楼2011-10-13 11:42:58
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2011-10-12 20:48:46:
2.7 K，不算很长啊，完全可以一次连上去的，为什么要分几次，还是4次，工作量不是大了很多。

因为够的表达质粒，引物是固定的，用基因组的基因作为模板的，基因比较复杂，很难P出来自己要的目的的。要是以质粒什么的作为模板，那就是固定死的，很容易P。所以才分4段的。。现在4段都已经构建好，要连接起来。出问题了。
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好好生活，努力赚钱
10楼2011-10-13 15:31:39
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