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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] 关于质粒的构建

小弟最近在做表达质粒的构建,由于目的片段较长(2700bp),根据载体上的酶切位点,将其分为四段,分别构建好之后,在逐一将其连接上。

遇到的问题:单独四个质粒构建好了,但是两两相互连接的时候却一直连接不上。(用NEB的T4连接酶10微升体系),求高手指点!!
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380218013

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2011-10-12 20:48:46:
2.7 K,不算很长啊,完全可以一次连上去的,为什么要分几次,还是4次,工作量不是大了很多。

因为够的表达质粒,引物是固定的,用基因组的基因作为模板的,基因比较复杂,很难P出来自己要的目的的。要是以质粒什么的作为模板,那就是固定死的,很容易P。所以才分4段的。。现在4段都已经构建好,要连接起来。出问题了。
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10楼2011-10-13 15:31:39
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查看全部 18 个回答

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

amisking: 2011-10-12 20:59:57
这个确实比较棘手一些。。。
祝你好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-10-12 20:23:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖


amisking(金币+1): 鼓励发帖交流! 2011-10-12 21:00:02
2.7 K,不算很长啊,完全可以一次连上去的,为什么要分几次,还是4次,工作量不是大了很多。
Thank-you,so-blue.
3楼2011-10-12 20:48:46
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ruth_3912834

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是啊,我也觉得没必要分成四段,我们有6K的都直接构建。
4楼2011-10-12 20:53:40
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