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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 想给自己的蛋白加个HIS标签？方法。。。。
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[求助] 想给自己的蛋白加个HIS标签？方法。。。。

自己有个重组质粒，带GST标签的蛋白，GST是质粒自身带的。能不能想个办法不要GST标签而换成HIS呢？ 还有his标签怎么加？？
我只想到了换种质粒。。。。
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我会绕一个圈，走回到实验室
1楼 2011-08-15 10:42:15
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-08-15 13:03:50
可以在设计引物的时候加在基因前边，然后用LIC的方法连到目的载体上。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-08-15 11:23:39
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
loveskyzhou(金币+1): 2011-08-15 12:36:23
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-08-15 13:04:02
楼主也可以先转到pet28等待有His的质粒上，在设计引物扩增！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-15 11:39:04
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
loveskyzhou(金币+1): 2011-08-15 12:36:30
西瓜(金币+2): 柯南君好久不见啊 2011-08-15 13:04:16
可以在设计引物的时候在引物上加标签
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4楼2011-08-15 12:11:56
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by elvias at 2011-08-15 12:11:56:
可以在设计引物的时候在引物上加标签

设计引物中的组氨酸序列随便写么还是有特殊的？ 还有就是位置是怎样的 紧挨着目的片段吗
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我会绕一个圈，走回到实验室
5楼2011-08-15 12:37:21
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good 2011-08-15 13:04:31
替换
用引物带上His tag。然后使用酶切或者其他方法，把his-目的基因，替换GST tag。
最方便的应该就是酶切了，找一个GST tag前合适的酶切位点，就OK了
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6楼2011-08-15 12:56:26
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

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引用回帖:
5楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-08-15 12:37:21:
设计引物中的组氨酸序列随便写么还是有特殊的？ 还有就是位置是怎样的 紧挨着目的片段吗

看你下面做什么实验了，我们一般都是将TEV或者thrombin的酶切位点跟在His后面，方便到时候切标签。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2011-08-15 13:06:02
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by roomofxw at 2011-08-15 12:56:26:
替换
用引物带上His tag。然后使用酶切或者其他方法，把his-目的基因，替换GST tag。
最方便的应该就是酶切了，找一个GST tag前合适的酶切位点，就OK了

6p-1的GST前没有没切位点啊，中间倒是有，但这样切的话蛋白还是会带一部分GST的序列，还需要酶切，这样的话是不是换载体方便些呢，比如28a的
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我会绕一个圈，走回到实验室
8楼2011-08-15 13:25:55
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-08-15 13:25:55:
6p-1的GST前没有没切位点啊，中间倒是有，但这样切的话蛋白还是会带一部分GST的序列，还需要酶切，这样的话是不是换载体方便些呢，比如28a的

你要是只是为了要His tag纯化用，那就用引物带上去，或者再带个蛋白酶切位点。即GST-（enzyme site-his）-protein。
要是就不要GST，那有pET载体，当然换质粒最容易。

非要在这个载体上替换的话。GST前面有BspmI酶切位点
觉得这个酶切位点不好用，那就再向上找，PCR把质粒上的片段和目的基因拼上去再连接。
当然也可以把质粒除了GST都P出来，然后和目的基因连接。
再或者自己把启动子RBS基因一起做出来，然后连到载体上。相当于设计个和GST共表达的载体。
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9楼2011-08-15 13:37:10
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