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满桌儿

金虫 (小有名气)

[求助] pcr，RACE,低表达量基因的克隆

新手求助，本人最近在做3‘RACE,是提取mRNA反转录做的，用了巢式PCR、也做了降落的，用了一个多月也没结果，实在郁闷，我有2个问题想请教下各位高手：1.我要做的基因表达的蛋白是膜内侧蛋白，表达量比较低，所以mRNA的量可能比较少，这应该怎么办呢？2.这个基因的CDS大概在800左右，我估计它的3’非编码区为200bp合适吗？  望各位高手帮忙解答下，小女子在此先谢过啦！
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1楼 2011-08-10 13:14:46
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-10 16:20:30
先保证RNA的质量，只要引物设计的合理，再低量得RNA也能扩得出来！至于3‘非编码区，扩出来是多少就是多少！祝楼主实验顺利哈
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2楼2011-08-10 15:48:20
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满桌儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by linyanfei at 2011-08-10 15:48:20:
先保证RNA的质量，只要引物设计的合理，再低量得RNA也能扩得出来！至于3‘非编码区，扩出来是多少就是多少！祝楼主实验顺利哈

RNA的质量应该是没问题的，因为我们实验室有人用同一RNA做出来了
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3楼2011-08-10 16:08:57
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hufei1010785

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-08-10 23:16:28
满桌儿(金币+1): 2011-08-11 16:24:20
非编码区一般都认为是200bp左右
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4楼2011-08-10 20:24:18
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-08-10 23:16:36
是的，模板少一点没关系，引物和退火温度应该比较重要吧
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-10 20:36:27
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满桌儿

金虫 (小有名气)
这样的啊，本来我还想提高下总RNA 浓度，看来没这个必要 了
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6楼2011-08-11 16:26:23
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yigeqbi

铜虫 (小有名气)
也在做，不是很理想
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7楼2011-09-19 10:39:29
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
该基因有无高GC或者高级结构？
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真相是最大的奢侈品
8楼2011-09-19 10:45:15
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)
3'-RACE很好做
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9楼2012-01-01 17:58:52
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