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满桌儿

金虫 (小有名气)

[求助] pcr,RACE,低表达量基因的克隆

新手求助,本人最近在做3‘RACE,是提取mRNA反转录做的,用了巢式PCR、也做了降落的,用了一个多月也没结果,实在郁闷,我有2个问题想请教下各位高手:1.我要做的基因表达的蛋白是膜内侧蛋白,表达量比较低,所以mRNA的量可能比较少,这应该怎么办呢?2.这个基因的CDS大概在800左右,我估计它的3’非编码区为200bp合适吗?  望各位高手帮忙解答下,小女子在此先谢过啦!
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-10 16:20:30
先保证RNA的质量,只要引物设计的合理,再低量得RNA也能扩得出来!至于3‘非编码区,扩出来是多少就是多少!祝楼主实验顺利哈
2楼2011-08-10 15:48:20
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满桌儿

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by linyanfei at 2011-08-10 15:48:20:
先保证RNA的质量,只要引物设计的合理,再低量得RNA也能扩得出来!至于3‘非编码区,扩出来是多少就是多少!祝楼主实验顺利哈

RNA的质量应该是没问题的,因为我们实验室有人用同一RNA做出来了
3楼2011-08-10 16:08:57
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hufei1010785

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-08-10 23:16:28
满桌儿(金币+1): 2011-08-11 16:24:20
非编码区一般都认为是200bp左右
4楼2011-08-10 20:24:18
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-08-10 23:16:36
是的,模板少一点没关系,引物和退火温度应该比较重要吧
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
5楼2011-08-10 20:36:27
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满桌儿

金虫 (小有名气)

这样的啊,本来我还想提高下总RNA 浓度,看来没这个必要 了
6楼2011-08-11 16:26:23
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yigeqbi

铜虫 (小有名气)

也在做,不是很理想
7楼2011-09-19 10:39:29
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

该基因有无高GC或者高级结构?
真相是最大的奢侈品
8楼2011-09-19 10:45:15
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)

3'-RACE很好做
9楼2012-01-01 17:58:52
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