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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 关于用农杆菌侵染法获得转基因植物的几点问题
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嫘诺

新虫 (小有名气)

[求助] 关于用农杆菌侵染法获得转基因植物的几点问题

虫友们，先遇到些难题，希望有懂得的给指点指点。现在这谢谢大家了。
现在我正在做转基因水稻，水稻品种为日本晴，实验过程中遇到了几点问题
1植株的分化率很低，具体没统计，不过一个皿里30-40块愈伤也就有3个出芽的。有的皿里一个也不出。
2分化的比较的慢，大约1个月才会有芽点出现，芽点出来后吧，长成小苗的时间也比较久。
3关于农杆菌侵染时的最佳OD值，是0.5呢还是0.8.OD值应该反映的菌的生长时期吧，那侵染时是不是采用的对数期的菌，那时OD值是多少呢？
4关于继代有文献称继代4次最好，有的则说可以去掉继代，各位又做转基因水稻的都继代几次啊？
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1楼 2011-08-06 18:23:36
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嫘诺

新虫 (小有名气)
★
jhu132llh(金币+1): 鼓励积极参与讨论 2011-12-29 10:12:16
引用回帖:
3楼: Originally posted by liling77ll at 2011-08-09 16:02:54:
我们一般采用，OD600=0.5左右，应该是菌生长最多的时候，分化率本来就不高的，只要得到的是阳性苗，只有一株都是成功的，按照自己正确的实验方法去做就好

非常感谢。实验方法是师姐留下来的方案，培养基配方啊，培养的过程，但是文献中报道的方法各有差异，比方说开始诱导愈伤时采用NB培养基，有的则用N6，分化培养基所加激素也不同，关键就是激素的比例，到底哪种比是最佳的。不知道仁兄实验室里采用的比较成熟的转化体系是是么样的？可否告知，万分感谢!!
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5楼2011-08-10 19:24:47
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嫘诺

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lihuaannie at 2011-08-10 13:28:12:
OD600=0.5左右，浸染时候愈伤的状态将会直接影响后面的分化，所以控制愈伤侵染时的状态非常重要。不知道你用什么筛选剂，HYG和G418分化率应该都还可以

关于愈伤的状态我也知道很重要，但是不知道怎么样才能在侵染时使愈伤达到最佳的状态，有的文献上说是继代4次较好，不过我做的我觉得愈伤养的时间久了，就老了，应该更不利于侵染和分化吧，我用的是继代一次的，继代的时候用的是NB0.5，然后在NBD2上又活化了4-5d的，不晓得这愈伤是个什么状态？筛选剂我用的是G418筛选的时候倒是还行，愈伤发褐的比较少，分化的时候继续筛的时候又有发褐的，就是分化率不高，一个皿里才几个，而且很慢。
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6楼2011-08-10 19:32:38
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:32:37
引用回帖:
1楼: Originally posted by 嫘诺 at 2011-08-06 18:23:36:
虫友们，先遇到些难题，希望有懂得的给指点指点。现在这谢谢大家了。
现在我正在做转基因水稻，水稻品种为日本晴，实验过程中遇到了几点问题
1植株的分化率很低，具体没统计，不过一个皿里30-40块愈伤也就有3个 ...

帮你顶一下，我觉得分化率低的话，介导过程出现转基因苗的机会也很低啊，能不能提高一下分化率。在考虑农杆菌介导。
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2楼2011-08-08 13:59:02
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liling77ll

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
嫘诺(金币+20): 5 2011-08-10 19:14:10
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:32:48
我们一般采用，OD600=0.5左右，应该是菌生长最多的时候，分化率本来就不高的，只要得到的是阳性苗，只有一株都是成功的，按照自己正确的实验方法去做就好
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做最好的自己，和自己的昨天对比
3楼2011-08-09 16:02:54
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:33:02
OD600=0.5左右，浸染时候愈伤的状态将会直接影响后面的分化，所以控制愈伤侵染时的状态非常重要。不知道你用什么筛选剂，HYG和G418分化率应该都还可以
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4楼2011-08-10 13:28:12
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嫘诺

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zqt123_1981 at 2011-08-08 13:59:02:
帮你顶一下，我觉得分化率低的话，介导过程出现转基因苗的机会也很低啊，能不能提高一下分化率。在考虑农杆菌介导。

谢谢，谢谢。我也在考虑如何才能让愈伤处于最佳状态，利于分化。
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7楼2011-08-10 19:35:34
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liling77ll

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:33:17
jhu132llh(金币+3): 鼓励积极参与讨论 2011-12-29 10:12:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by 嫘诺 at 2011-08-10 19:24:47:
非常感谢。实验方法是师姐留下来的方案，培养基配方啊，培养的过程，但是文献中报道的方法各有差异，比方说开始诱导愈伤时采用NB培养基，有的则用N6，分化培养基所加激素也不同，关键就是激素的比例，到底哪种比 ...

我们实验室用的继代用的是NB，一般2次，其配方如下
NB培养基配方（基本培养基）
N6大量 B5微量 铁盐 肌醇 2,4-D ，B5-有机，其中有机中含有辅加物，倒培养基时抽滤加入，2,4-D一般2-3毫克每升
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做最好的自己，和自己的昨天对比
8楼2011-08-11 17:15:11
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嫘诺

新虫 (小有名气)
★
jhu132llh(金币+1): 鼓励积极参与讨论 2011-12-29 10:12:30
引用回帖:
8楼: Originally posted by liling77ll at 2011-08-11 17:15:11:
我们实验室用的继代用的是NB，一般2次，其配方如下
NB培养基配方（基本培养基）
N6大量 B5微量 铁盐 肌醇 2,4-D ，B5-有机，其中有机中含有辅加物，倒培养基时抽滤加入，2,4-D一般2-3毫克每升

谢谢，谢谢。我们实验室也是用的NB培养基，不过培养的时候比较的麻烦，先在NB2上培养，继代在NB0.5上，侵染前又转到了NB2上，2，和0.5指的是2,4-D的浓度是0.5,2mg/L,不过昨天我又看了篇文献说诱导和继代在光下培养有利于分化率的提高，不知道仁兄实验室是光培养还是暗培养，我之前一直用的是暗培，不知道是否对分化率产生了影响。还有关于温度，有的使用的是30度。这就属于高温了吧，先在看文献看的都搞不懂那些可信，那些不可信了。还有篇文献说农杆菌侵染做转基因水稻，40天就可得到转基因植株，不知道真假？
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9楼2011-08-12 08:42:29
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897611428

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,感谢新虫积极应助 2011-10-14 20:37:19
我们侵染OD600=1.6 然后侵染液二倍菌液 OD600=0.8  效果和文献说的差不多 0.01的转化率
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在北漂
10楼2011-10-14 19:23:04
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