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嫘诺

新虫 (小有名气)

[求助] 关于用农杆菌侵染法获得转基因植物的几点问题

虫友们,先遇到些难题,希望有懂得的给指点指点。现在这谢谢大家了。
现在我正在做转基因水稻,水稻品种为日本晴,实验过程中遇到了几点问题
1植株的分化率很低,具体没统计,不过一个皿里30-40块愈伤也就有3个出芽的。有的皿里一个也不出。
2分化的比较的慢,大约1个月才会有芽点出现,芽点出来后吧,长成小苗的时间也比较久。
3关于农杆菌侵染时的最佳OD值,是0.5呢还是0.8.OD值应该反映的菌的生长时期吧,那侵染时是不是采用的对数期的菌,那时OD值是多少呢?
4关于继代有文献称继代4次最好,有的则说可以去掉继代,各位又做转基因水稻的都继代几次啊?
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嫘诺

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lihuaannie at 2011-08-10 13:28:12:
OD600=0.5左右,浸染时候愈伤的状态将会直接影响后面的分化,所以控制愈伤侵染时的状态非常重要。不知道你用什么筛选剂,HYG和G418分化率应该都还可以

关于愈伤的状态我也知道很重要,但是不知道怎么样才能在侵染时使愈伤达到最佳的状态,有的文献上说是继代4次较好,不过我做的我觉得愈伤养的时间久了,就老了,应该更不利于侵染和分化吧,我用的是继代一次的,继代的时候用的是NB0.5,然后在NBD2上又活化了4-5d的,不晓得这愈伤是个什么状态?筛选剂我用的是G418筛选的时候倒是还行,愈伤发褐的比较少,分化的时候继续筛的时候又有发褐的,就是分化率不高,一个皿里才几个,而且很慢。
6楼2011-08-10 19:32:38
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:32:37
引用回帖:
1楼: Originally posted by 嫘诺 at 2011-08-06 18:23:36:
虫友们,先遇到些难题,希望有懂得的给指点指点。现在这谢谢大家了。
现在我正在做转基因水稻,水稻品种为日本晴,实验过程中遇到了几点问题
1植株的分化率很低,具体没统计,不过一个皿里30-40块愈伤也就有3个 ...

帮你顶一下,我觉得分化率低的话,介导过程出现转基因苗的机会也很低啊,能不能提高一下分化率。在考虑农杆菌介导。
2楼2011-08-08 13:59:02
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liling77ll

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
嫘诺(金币+20): 5 2011-08-10 19:14:10
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:32:48
我们一般采用,OD600=0.5左右,应该是菌生长最多的时候,分化率本来就不高的,只要得到的是阳性苗,只有一株都是成功的,按照自己正确的实验方法去做就好
做最好的自己,和自己的昨天对比
3楼2011-08-09 16:02:54
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
jhu132llh(金币+2): 鼓励积极应助 2011-12-26 10:33:02
OD600=0.5左右,浸染时候愈伤的状态将会直接影响后面的分化,所以控制愈伤侵染时的状态非常重要。不知道你用什么筛选剂,HYG和G418分化率应该都还可以
4楼2011-08-10 13:28:12
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