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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE之后的PCR P不出来了
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PAOs

木虫 (小有名气)

[求助] DGGE之后的PCR P不出来了

大家好，我做全菌的DGGE后的PCR，用的50微升的体系：
968F：2微升
1392R：2微升
DNTP（mix）：2微升
10*buffer：5微升
Mg离子：3微升
Taq酶：0.3微升

程序：94℃：5min
          94℃：30s
          55℃：30s
         72℃：30s
        72℃：10min

第一轮以溶解的DGGE胶中DNA为模板，1微升
http://good.gd/1388625.htm
http://good.gd/1388633.htm
第二轮以第一轮PCR产物为模板，1微升。
http://good.gd/1388636.htm

第一轮还好，有点条带，可第二轮不知道怎的整条泳道都是亮的。我不是很懂分子生物学，请大家支支招，万分感激。
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1楼 2011-07-11 22:29:39
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biocontrol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
PAOs(金币+10): 谢谢 2011-07-12 16:06:21
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-07-12 19:24:51
不知道楼主为什么要两次PCR？两次用一样的引物呢？！DGGE条带一次扩增就可以。第二次非特异性扩增忒强了。如果你是想测序的话，一次扩增就可以，浓度低的话，多P几管，浓缩。
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裸奔进行时...
2楼2011-07-11 22:40:16
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PAOs

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biocontrol at 2011-07-11 22:40:16:
不知道楼主为什么要两次PCR？两次用一样的引物呢？！DGGE条带一次扩增就可以。第二次非特异性扩增忒强了。如果你是想测序的话，一次扩增就可以，浓度低的话，多P几管，浓缩。

我是想PCR后进行克隆转化，再测序的。有些样品第一轮的时候确实一点亮条带都没，所以当时考虑在以第一轮的产物为模板进行PCR，希望得到比较量的条带。

您说的多p几管进行浓缩是用纯化试剂盒进行浓缩吗？还是怎么做呢？对这个我不是很懂，希望您指教。谢谢！
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3楼2011-07-12 16:00:38
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biocontrol

金虫 (小有名气)
其实最好的方法就是你说的，做克隆。如果第一次PCR没有条带，可以优化一下pcr条件。酒精浓缩就可以把。试剂盒更好。
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裸奔进行时...
4楼2011-07-12 17:04:52
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PAOs

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biocontrol at 2011-07-12 17:04:52:
其实最好的方法就是你说的，做克隆。如果第一次PCR没有条带，可以优化一下pcr条件。酒精浓缩就可以把。试剂盒更好。

恩，谢谢了
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5楼2011-07-12 18:25:15
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zhangxianqin

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-08-16 11:40:40
扩一次就可以了。第二次是因为你第一次扩出来后杂片段也多，出现了很多的模板，在扩出来当然就整个泳道都是亮的了。
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6楼2011-08-16 10:15:59
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201014162

金虫 (正式写手)
楼主 我最近再做F968和R1401做引物的DGGE，一直分的不好，请问你的DGGE胶浓度和丙烯酰胺浓度多少？电泳时间多少？
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生命在于奋斗
7楼2012-08-31 08:03:04
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