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PAOs

木虫 (小有名气)

[求助] DGGE之后的PCR P不出来了

大家好,我做全菌的DGGE后的PCR,用的50微升的体系:
968F:2微升
1392R:2微升
DNTP(mix):2微升
10*buffer:5微升
Mg离子:3微升
Taq酶:0.3微升

程序:94℃:5min
          94℃:30s
          55℃:30s
         72℃:30s
        72℃:10min

第一轮以溶解的DGGE胶中DNA为模板,1微升
http://good.gd/1388625.htm
http://good.gd/1388633.htm
第二轮以第一轮PCR产物为模板,1微升。
http://good.gd/1388636.htm

第一轮还好,有点条带,可第二轮不知道怎的整条泳道都是亮的。我不是很懂分子生物学,请大家支支招,万分感激。
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biocontrol

金虫 (小有名气)

其实最好的方法就是你说的,做克隆。如果第一次PCR没有条带,可以优化一下pcr条件。酒精浓缩就可以把。试剂盒更好。
裸奔进行时...
4楼2011-07-12 17:04:52
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biocontrol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
PAOs(金币+10): 谢谢 2011-07-12 16:06:21
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-07-12 19:24:51
不知道楼主为什么要两次PCR?两次用一样的引物呢?!DGGE条带一次扩增就可以。第二次非特异性扩增忒强了。如果你是想测序的话,一次扩增就可以,浓度低的话,多P几管,浓缩。
裸奔进行时...
2楼2011-07-11 22:40:16
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PAOs

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by biocontrol at 2011-07-11 22:40:16:
不知道楼主为什么要两次PCR?两次用一样的引物呢?!DGGE条带一次扩增就可以。第二次非特异性扩增忒强了。如果你是想测序的话,一次扩增就可以,浓度低的话,多P几管,浓缩。

我是想PCR后进行克隆转化,再测序的。有些样品第一轮的时候确实一点亮条带都没,所以当时考虑在以第一轮的产物为模板进行PCR,希望得到比较量的条带。

您说的多p几管进行浓缩是用纯化试剂盒进行浓缩吗?还是怎么做呢?对这个我不是很懂,希望您指教。谢谢!
3楼2011-07-12 16:00:38
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PAOs

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by biocontrol at 2011-07-12 17:04:52:
其实最好的方法就是你说的,做克隆。如果第一次PCR没有条带,可以优化一下pcr条件。酒精浓缩就可以把。试剂盒更好。

恩,谢谢了
5楼2011-07-12 18:25:15
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