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王营wy

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助DGGE割胶回收测序问题

DGGE跑完后进行银染,然后割胶回收两个主要条带(两者有一定距离不会割胶后在一起),各自进行PCR扩增,再进行DGGE电泳比对两条带是否与之前回收的条带一致。结果PCR后所得的条带及亮度均达到满意效果,但再次DGGE进行验证条带时发现每一个回收的条带均含有与之前回收的两个条带一致的两条条带,在这种情况下不知道能否送去测序?帮帮我吧,非常着急,非常感谢!!!
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DGGE

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阳光总在风雨后
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王营wy

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-06-30 22:54:19:
直接送样测序可能会得到“套局部峰”的结果。

我觉得可以连T载体,多送几个克隆去测序。

非常感谢你的帮助,我感觉每次割胶回收条带PCR扩增后琼脂糖电泳结果很好,但DGGE都会出现两个条带,好像两个条带是PCR扩增同时产生的,不知道该如何处理了
阳光总在风雨后
3楼2011-07-01 10:26:00
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王营wy

新虫 (初入文坛)

谢谢brightfuture01的帮助,非常感谢!!!
阳光总在风雨后
5楼2011-07-05 17:50:32
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王营wy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by wubingqi at 2011-07-06 10:53:47:
是的,必须要连接载体进行测序,否者会出现双峰的情况。
切胶后扩增pcr重新跑dgge出现两条带,说明在第一次DGGE时没有完全分开。DGGE就是这样,看着是一条带实际上可能会有好几条。

我的两个条带是切胶前后跑DGGE都有,而且两个条带距离挺大,应该不是没分开的情况,好像是在PCR扩增中跟我要的条带一起扩增出现的。你说的连T载体测序是还要转到大肠杆菌感受态中,涂板筛选阳性克隆,再PCR测序,是这么个过程吗?
阳光总在风雨后
8楼2011-07-08 13:12:29
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王营wy

新虫 (初入文坛)

谢谢wubingqi 的建议,我会试试看,非常感谢!
阳光总在风雨后
13楼2011-07-12 21:49:13
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王营wy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by lanhuaorchid at 2011-07-12 21:44:28:
你好,我想请教一下DGGE的胶回收怎样做呀?万分感谢
祝实验顺利

我胶回收是按下面步骤做的:切下的DNA条带放入EP管中,加入0.5ml的去离子水清洗,离心,去上清,此冲洗步骤重复2-3次,加入50μLddH2O,4°C 过夜保存。2000rpm离心5min,取10μL上清作为PCR模板。
阳光总在风雨后
14楼2011-07-12 21:53:12
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王营wy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by mada1986 at 2011-07-14 13:29:29:
我怎么觉得是引物的问题呢 楼主两次PCR的引物是一样的吗?

两次引物是一样的,都是带GC板夹的引物,有问题,可能真需要克隆测序
阳光总在风雨后
18楼2011-07-14 17:23:40
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王营wy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by yanhuifan at 2011-07-14 15:55:45:
我以前用聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒,最近直接切胶后加TE用枪头捣碎,然后离心吸上清作为模板,用不带GC夹的引物再次扩增,条带还是很纯的,但是去测序就有套峰,估计是切的不太好

切的不好也有可能,可是我的那两个条带离得很远,按道理说应该不会啊!下次多注意下交叉污染的问题
阳光总在风雨后
19楼2011-07-14 17:25:55
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