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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE切胶回收的问题，望高人指点迷津
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wjt5856

木虫 (小有名气)

[求助] DGGE切胶回收的问题，望高人指点迷津

有没有高人指点下，做的都快绝望了。连着这次已经四次了，真核的18S rDNA；EUK1A-EUK516R；土壤样品。
    每次都是DGGE做出来的效果非常好，然后切胶回收的时候出了问题，模板怎么都没有出来。捣的足够碎（20孔的胶至少捣成8节），切胶时候紫外也没有长时间照射。只有阳性对照P出来，其他的切胶回收模板只有很亮的引物二聚体。体系，引物什么的都没有问题，BUFFER也换的全新的。无论是当时直接P还是放置过夜还是温育，都P不出来。
    之前实验室其他人做的切出来都能P出来，到我这里就卡掉了。能想到的都想了，实在是不明白哪里出了问题。我RP没那没低的啊
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1楼2011-06-30 15:03:09
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
按照试剂盒操作一般没问题的，多少总能回收点呀。让别人帮你做一次看看吧。
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2楼2011-06-30 16:46:23
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 学习了！ 2011-07-01 12:29:04
引用回帖:
Originally posted by wjt5856 at 2011-06-30 15:03:09:
有没有高人指点下，做的都快绝望了。连着这次已经四次了，真核的18S rDNA；EUK1A-EUK516R；土壤样品。
    每次都是DGGE做出来的效果非常好，然后切胶回收的时候出了问题，模板怎么都没有出来。捣的足够碎（ ...

教你个新方法

胶切下来，不要捣碎，直接放在1.5mL离心管里，里面加上50uL无菌水，4度冰箱放一晚上，第二天以2uL上清为模板进行PCR，绝对OK。
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3楼2011-07-01 09:00:21
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wjt5856

木虫 (小有名气)
以前实验室有做过的不捣碎的，但是基本P不出来。所以现在我们实验室都是捣碎的。不过谢谢三楼提点。我回头再试下。另外你说上清液，我想问：我的做法是把切胶捣碎了震荡了几次，然后又10000×g离心了，结果没P出来。我想问是不是这样反而有副作用呢？
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4楼2011-07-01 10:26:42
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wjt5856

木虫 (小有名气)
回复二楼：我最后一次也是请切胶达人帮我切了胶，不过还是没出来，应该就是模板提取出了问题。哎，悲催啊
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5楼2011-07-01 10:29:16
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苏运芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也在做DGGE胶回收。不加模板都能P出来，简直了，怀疑是水或者MIX，引物什么的被污染了，哎，纠结啊，正在做蓝白斑筛选测序呢，没有模板的都能P出条带，这测序能测吗？！
请问LZ也做回收测序吗？
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6楼2011-07-01 10:55:17
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wjt5856

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 苏运芳 at 2011-07-01 10:55:17:
我也在做DGGE胶回收。不加模板都能P出来，简直了，怀疑是水或者MIX，引物什么的被污染了，哎，纠结啊，正在做蓝白斑筛选测序呢，没有模板的都能P出条带，这测序能测吗？！
请问LZ也做回收测序吗？

你做的是16S 吧这么容易污染。我的一直在回收这步卡住了，没做到筛蓝白斑呢
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7楼2011-07-01 12:09:29
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wjt5856 at 2011-07-01 10:26:42:
以前实验室有做过的不捣碎的，但是基本P不出来。所以现在我们实验室都是捣碎的。不过谢谢三楼提点。我回头再试下。另外你说上清液，我想问：我的做法是把切胶捣碎了震荡了几次，然后又10000×g离心了，结果没P出来 ...

一般来说，如果P不成功，应该是Ag离子抑制了酶的活性，把胶捣烂了可能使得Ag浓度更高了吧。我是这么认为，不知道对不对。

我一直都是4度过夜，DNA析出到无菌水中，去2uL水进行PCR，很少有扩增不出来的。
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wjt5856
8楼2011-07-01 12:55:02
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-07-01 13:05:37
引用回帖:
Originally posted by 苏运芳 at 2011-07-01 10:55:17:
我也在做DGGE胶回收。不加模板都能P出来，简直了，怀疑是水或者MIX，引物什么的被污染了，哎，纠结啊，正在做蓝白斑筛选测序呢，没有模板的都能P出条带，这测序能测吗？！
请问LZ也做回收测序吗？

要是没见模板都P出来了，那肯定是污染了。

从各个方面找原因之外，还要注意PCR时环境中的细菌污染，所以整个操作还得严格一下，避免各种可能的污染。

多注意一下应该没什么问题。
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9楼2011-07-01 12:56:39
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wjt5856

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-01 12:55:02:
一般来说，如果P不成功，应该是Ag离子抑制了酶的活性，把胶捣烂了可能使得Ag浓度更高了吧。我是这么认为，不知道对不对。

我一直都是4度过夜，DNA析出到无菌水中，去2uL水进行PCR，很少有扩增不出来的。

我们用的是SYBR染色的。而且我也做过1000倍的浓度稀释，还是没有效果
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10楼2011-07-04 09:48:57
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