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wjt5856

木虫 (小有名气)

[求助] DGGE切胶回收的问题,望高人指点迷津

有没有高人指点下,做的都快绝望了。连着这次已经四次了,真核的18S rDNA;EUK1A-EUK516R;土壤样品。
    每次都是DGGE做出来的效果非常好,然后切胶回收的时候出了问题,模板怎么都没有出来。捣的足够碎(20孔的胶至少捣成8节),切胶时候紫外也没有长时间照射。只有阳性对照P出来,其他的切胶回收模板只有很亮的引物二聚体。体系,引物什么的都没有问题,BUFFER也换的全新的。无论是当时直接P还是放置过夜还是温育,都P不出来。
    之前实验室其他人做的切出来都能P出来,到我这里就卡掉了。能想到的都想了,实在是不明白哪里出了问题。我RP没那没低的啊
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苏运芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也在做DGGE胶回收。不加模板都能P出来,简直了,怀疑是水或者MIX,引物什么的被污染了,哎,纠结啊,正在做蓝白斑筛选测序呢,没有模板的都能P出条带,这测序能测吗?!
请问LZ也做回收测序吗?
6楼2011-07-01 10:55:17
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查看全部 19 个回答

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

按照试剂盒操作一般没问题的,多少总能回收点呀。让别人帮你做一次看看吧。
2楼2011-06-30 16:46:23
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 学习了! 2011-07-01 12:29:04
引用回帖:
Originally posted by wjt5856 at 2011-06-30 15:03:09:
有没有高人指点下,做的都快绝望了。连着这次已经四次了,真核的18S rDNA;EUK1A-EUK516R;土壤样品。
    每次都是DGGE做出来的效果非常好,然后切胶回收的时候出了问题,模板怎么都没有出来。捣的足够碎( ...

教你个新方法

胶切下来,不要捣碎,直接放在1.5mL离心管里,里面加上50uL无菌水,4度冰箱放一晚上,第二天以2uL上清为模板进行PCR,绝对OK。
3楼2011-07-01 09:00:21
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wjt5856

木虫 (小有名气)

以前实验室有做过的不捣碎的,但是基本P不出来。所以现在我们实验室都是捣碎的。不过谢谢三楼提点。我回头再试下。另外你说上清液,我想问:我的做法是把切胶捣碎了震荡了几次,然后又10000×g离心了,结果没P出来。我想问是不是这样反而有副作用呢?
4楼2011-07-01 10:26:42
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