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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌基因组DNA提取问题
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[求助] 细菌基因组DNA提取问题

1.挑单菌落于3ml培养基中，37℃过夜培养
2.取3ml菌液于EP管中8000rmp/min离心2min，收集菌体。

3、加100ulTE重悬菌体（仪器：漩涡振荡器）8000 rpm/min离心 2min。

4、去上清，注意吸干多余的水分，沉淀物加入50ulTE缓冲液，反复吹打重悬菌体，加入50ul溶菌酶，混匀后37℃水浴30min
5加入460ulTE，加入30ul 10%SDS，混匀，加入蛋白酶K3ul，37℃温浴30min以上直到溶液变澄清。澄清后，加入200ul 5mol/l的NaCl，充分混匀后，再加入预热好的200ul CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温浴30min
6.10000rpm/min离心5min取上清后后再加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，12000rpm/min离心5min取上清，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止。
7.加入等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。充分混匀后，12000r/min离心5min，吸取上清。重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止。
8、小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，在冰上放置1-2h或放冰箱冻存1-2h，沉淀后，再以12000rpm/min离心10min。
9、用500μL 70%的乙醇洗涤两次，每次12000rmp/min离心2min，然后倒掉上清液（一定要倒扣离心管足够长的时间，是乙醇尽可能流干净，否则不易风干）。
10、真空干燥后，用50μLTE或超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用

我用这个方法提取的基因组DNA，以前怎么提取都没问题，但是最近提取总是降解，混匀的时候已经很轻了但是还是降解，还有其他导致降解的原因吗？后来我用试剂盒提取也降解，这和气温高有关系吗？操作的时候需要在冰上否？另外配好的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）溶液放在冰箱里是分层用的时候要混匀再用吗？
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1楼 2011-06-24 12:51:02
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lilirong2009(金币+1): 2011-07-07 12:16:10
lilirong2009(金币+1): 2011-09-16 16:46:29
降解很可能与夏天室温高有关系，建议你有TE溶
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-06-26 21:45:40
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他她0328

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

lilirong2009(金币+1): 2011-07-07 12:16:19
lilirong2009(金币+1): 2011-09-16 16:46:37
通常需要在冰上进行的，尤其夏天。Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）溶液用前不需要摇匀，上面那层是Tris，用的时候吸下面那层
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3楼2011-07-03 19:06:05
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