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lilirong2009铜虫 (小有名气)
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[求助]
细菌基因组DNA提取问题
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1.挑单菌落于3ml培养基中，37℃过夜培养 2.取3ml菌液于EP管中8000rmp/min离心2min，收集菌体。 3、加100ulTE重悬菌体（仪器：漩涡振荡器）8000 rpm/min离心 2min。 4、去上清，注意吸干多余的水分，沉淀物加入50ulTE缓冲液，反复吹打重悬菌体，加入50ul溶菌酶，混匀后37℃水浴30min 5加入460ulTE，加入30ul 10%SDS，混匀，加入蛋白酶K3ul，37℃温浴30min以上直到溶液变澄清。澄清后，加入200ul 5mol/l的NaCl，充分混匀后，再加入预热好的200ul CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温浴30min 6.10000rpm/min离心5min取上清后后再加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，12000rpm/min离心5min取上清，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止。 7.加入等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。充分混匀后，12000r/min离心5min，吸取上清。重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止。 8、小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，在冰上放置1-2h或放冰箱冻存1-2h，沉淀后，再以12000rpm/min离心10min。 9、用500μL 70%的乙醇洗涤两次，每次12000rmp/min离心2min，然后倒掉上清液（一定要倒扣离心管足够长的时间，是乙醇尽可能流干净，否则不易风干）。 10、真空干燥后，用50μLTE或超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用 我用这个方法提取的基因组DNA，以前怎么提取都没问题，但是最近提取总是降解，混匀的时候已经很轻了但是还是降解，还有其他导致降解的原因吗？后来我用试剂盒提取也降解，这和气温高有关系吗？操作的时候需要在冰上否？另外配好的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）溶液放在冰箱里是分层用的时候要混匀再用吗？ |
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