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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠pcr\跳跃pcr的问题
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yanhui8558

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠pcr\跳跃pcr的问题

我现在在进行重叠pcr，想要把一段基因中间的内含子去除，上游片段1600左右，下游片段500左右，先分别p出上下游片段，然后进行重叠延伸步骤。实验条件如下：
中间上片段下引物和下片段上引物重叠区域大概50个bp，先不加入引物，让上下游引物自连，用的是pcr混合物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，40度30秒，72度，1分40秒，72度10分钟，2-4步循环10次，然后加入上片段上引物和下片段下引物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，50度30秒，72度，2分，72度10分钟，2-4步循环30次.
延伸温度也做过50-65的梯度，也加入过DMSO 试验过，
可是一直没有成功，忘各位大侠指导，或者可以指出可能是哪方面的问题啊，感激不尽
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1楼 2011-06-23 15:49:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎交流 2011-06-25 20:51:54
yanhui8558(金币+1): 2011-06-30 13:47:24
我的实验：三个片段分别PCR，重叠22-25 bp，切胶回收（50体系，30洗脱），各取0.5混合，直接第二次PCR。需要说明的是，第二次PCR我做了梯度，发现模板最少的产物最多，各加3时就完全smer了。两段的应该比三段的好做吧。
赞一下(2人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
7楼2011-06-25 20:41:50
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普通回帖

zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yanhui8558(金币+1): 2011-06-23 17:01:15
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-23 19:20:26
分段的上下片段都是PCR产物，浓度很高的，但是在第二轮的扩增中其实就是个模板的作用，千万不要加太多了，加多了就把第二轮的引物全部饱和掉了，因为不了解具体情况，也不好建议加多少，方便的话，做个梯度试试。
另外，分段的上下片段在做第二轮之前，稍微纯化下，把第一次PCR之后的残留引物，副产物什么的去掉，避免干扰第二轮的扩增。
试试看吧！
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2楼2011-06-23 16:53:04
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yanhui8558

金虫 (小有名气)
已经对上下游片段进行了20、30、40、50、60倍的稀释
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3楼2011-06-23 17:00:32
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-23 20:42:56
yanhui8558(金币+1): 2011-06-24 18:45:29
之前一直在做这类实验

A片段1100，B片段3500
AB片段重叠30bp

A、B片段切胶回收纯化。

A片段上引物和B片段下引物各20bp，加入双模板用量A:B=1:3，按照正常PCR操作直接PCR，体系：50ul。几乎没有失手过。

祝楼主早日成功。
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4楼2011-06-23 20:40:36
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yanhui8558

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-06-23 20:40:36:
之前一直在做这类实验

A片段1100，B片段3500
AB片段重叠30bp

A、B片段切胶回收纯化。

A片段上引物和B片段下引物各20bp，加入双模板用量A:B=1:3，按照正常PCR操作直接PCR，体系：50ul。几乎没有失手过。 ...

我也是切胶回收的，问题会出在哪 呢，奇怪得很啊
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5楼2011-06-24 18:46:36
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proteinwang

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励 2011-06-24 20:41:03
yanhui8558(金币+1): 2011-06-24 21:07:59
yanhui8558(金币+2): 谢谢，再做不出来我就重新设计引物 2011-06-24 21:08:57
根据我个人的经验，重叠区域一般不需要50bp，太长甚至容易出问题；
两片段融合的的话，20-30bp即可。
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6楼2011-06-24 19:38:55
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q307078056

银虫 (正式写手)
嗯，不懂了呢，帮顶！
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人生不是一种享受，而是一桩沉重异常的工作
8楼2011-06-26 10:35:22
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-29 10:54:14
先提个问题，楼主的基因已经克隆到载体了么？
如果长的片段已经克隆到载体，而且只需要去除一个内含子的话，可以直接在你克隆好的载体的基础上设计引物，反向扩增，然后平末端连接。可能退火的时间有点长，不过这样应该没有问题。
只是提个建议。
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yanhui8558
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2011-06-29 09:47:01
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yanhui8558

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by xujian568 at 2011-06-29 09:47:01:
先提个问题，楼主的基因已经克隆到载体了么？
如果长的片段已经克隆到载体，而且只需要去除一个内含子的话，可以直接在你克隆好的载体的基础上设计引物，反向扩增，然后平末端连接。可能退火的时间有点长，不过这 ...

是已经克隆到载体了，你说的这种方法我没试过，我试试，谢谢
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10楼2011-06-30 13:51:06
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