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yanhui8558

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[求助] 重叠pcr\跳跃pcr的问题

我现在在进行重叠pcr，想要把一段基因中间的内含子去除，上游片段1600左右，下游片段500左右，先分别p出上下游片段，然后进行重叠延伸步骤。实验条件如下：
中间上片段下引物和下片段上引物重叠区域大概50个bp，先不加入引物，让上下游引物自连，用的是pcr混合物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，40度30秒，72度，1分40秒，72度10分钟，2-4步循环10次，然后加入上片段上引物和下片段下引物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，50度30秒，72度，2分，72度10分钟，2-4步循环30次.
延伸温度也做过50-65的梯度，也加入过DMSO 试验过，
可是一直没有成功，忘各位大侠指导，或者可以指出可能是哪方面的问题啊，感激不尽

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1楼 2011-06-23 15:49:21

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yanhui8558

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已经对上下游片段进行了20、30、40、50、60倍的稀释

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3楼2011-06-23 17:00:32

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yanhui8558

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引用回帖:

Originally posted by gwbk at 2011-06-23 20:40:36:
之前一直在做这类实验

A片段1100，B片段3500
AB片段重叠30bp

A、B片段切胶回收纯化。

A片段上引物和B片段下引物各20bp，加入双模板用量A:B=1:3，按照正常PCR操作直接PCR，体系：50ul。几乎没有失手过。 ...

我也是切胶回收的，问题会出在哪呢，奇怪得很啊

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5楼2011-06-24 18:46:36

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引用回帖:

Originally posted by xujian568 at 2011-06-29 09:47:01:
先提个问题，楼主的基因已经克隆到载体了么？
如果长的片段已经克隆到载体，而且只需要去除一个内含子的话，可以直接在你克隆好的载体的基础上设计引物，反向扩增，然后平末端连接。可能退火的时间有点长，不过这 ...

是已经克隆到载体了，你说的这种方法我没试过，我试试，谢谢

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10楼2011-06-30 13:51:06

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