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yanhui8558金虫 (小有名气)
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[求助]
重叠pcr\跳跃pcr的问题
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我现在在进行重叠pcr，想要把一段基因中间的内含子去除，上游片段1600左右，下游片段500左右，先分别p出上下游片段，然后进行重叠延伸步骤。实验条件如下： 中间上片段下引物和下片段上引物重叠区域大概50个bp，先不加入引物，让上下游引物自连，用的是pcr混合物，pcr条件： 94度3分钟，94度45秒，40度30秒，72度，1分40秒，72度10分钟，2-4步循环10次，然后加入上片段上引物和下片段下引物，pcr条件： 94度3分钟，94度45秒，50度30秒，72度，2分，72度10分钟，2-4步循环30次. 延伸温度也做过50-65的梯度，也加入过DMSO 试验过， 可是一直没有成功，忘各位大侠指导，或者可以指出可能是哪方面的问题啊，感激不尽  |
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xujian568
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-29 10:54:14
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-29 10:54:14
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先提个问题，楼主的基因已经克隆到载体了么？ 如果长的片段已经克隆到载体，而且只需要去除一个内含子的话，可以直接在你克隆好的载体的基础上设计引物，反向扩增，然后平末端连接。可能退火的时间有点长，不过这样应该没有问题。 只是提个建议。  |
yanhui8558
9楼2011-06-29 09:47:01
2楼2011-06-23 16:53:04
yanhui8558
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3楼2011-06-23 17:00:32
gwbk
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4楼2011-06-23 20:40:36
5