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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠pcr\跳跃pcr的问题
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yanhui8558

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠pcr\跳跃pcr的问题

我现在在进行重叠pcr，想要把一段基因中间的内含子去除，上游片段1600左右，下游片段500左右，先分别p出上下游片段，然后进行重叠延伸步骤。实验条件如下：
中间上片段下引物和下片段上引物重叠区域大概50个bp，先不加入引物，让上下游引物自连，用的是pcr混合物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，40度30秒，72度，1分40秒，72度10分钟，2-4步循环10次，然后加入上片段上引物和下片段下引物，pcr条件：
94度3分钟，94度45秒，50度30秒，72度，2分，72度10分钟，2-4步循环30次.
延伸温度也做过50-65的梯度，也加入过DMSO 试验过，
可是一直没有成功，忘各位大侠指导，或者可以指出可能是哪方面的问题啊，感激不尽
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1楼 2011-06-23 15:49:21
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-29 10:54:14
先提个问题，楼主的基因已经克隆到载体了么？
如果长的片段已经克隆到载体，而且只需要去除一个内含子的话，可以直接在你克隆好的载体的基础上设计引物，反向扩增，然后平末端连接。可能退火的时间有点长，不过这样应该没有问题。
只是提个建议。
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yanhui8558
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2011-06-29 09:47:01
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yanhui8558(金币+1): 2011-06-23 17:01:15
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-23 19:20:26
分段的上下片段都是PCR产物，浓度很高的，但是在第二轮的扩增中其实就是个模板的作用，千万不要加太多了，加多了就把第二轮的引物全部饱和掉了，因为不了解具体情况，也不好建议加多少，方便的话，做个梯度试试。
另外，分段的上下片段在做第二轮之前，稍微纯化下，把第一次PCR之后的残留引物，副产物什么的去掉，避免干扰第二轮的扩增。
试试看吧！
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2楼2011-06-23 16:53:04
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yanhui8558

金虫 (小有名气)
已经对上下游片段进行了20、30、40、50、60倍的稀释
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3楼2011-06-23 17:00:32
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-23 20:42:56
yanhui8558(金币+1): 2011-06-24 18:45:29
之前一直在做这类实验

A片段1100，B片段3500
AB片段重叠30bp

A、B片段切胶回收纯化。

A片段上引物和B片段下引物各20bp，加入双模板用量A:B=1:3，按照正常PCR操作直接PCR，体系：50ul。几乎没有失手过。

祝楼主早日成功。
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4楼2011-06-23 20:40:36
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