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YongfengWang铁虫 (初入文坛)
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real time PCR能测定基因组内某一基因的拷贝数吗？
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| real time PCR能测定基因组内某一基因的拷贝数吗？我怎么认为只能检测模版浓度？如果能测定基因的拷贝数，原理是什么，帮忙解释一下，坐等，谢谢 |
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5楼2012-08-31 09:21:03
beautybanana
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【答案】应助回帖
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YongfengWang(金币+2): 好像忽然开窍了，测定时应该先测定基因组模版的质量浓度和含参照基因而不含目的基因的基因组模版质量浓度，我问题里说的应该是摩尔浓度，谢谢啦 2011-06-09 22:08:01
西瓜(金币+3): 鼓励交流，费心了哦。 2011-06-09 23:20:49
YongfengWang(金币+2): 好像忽然开窍了，测定时应该先测定基因组模版的质量浓度和含参照基因而不含目的基因的基因组模版质量浓度，我问题里说的应该是摩尔浓度，谢谢啦 2011-06-09 22:08:01
西瓜(金币+3): 鼓励交流，费心了哦。 2011-06-09 23:20:49
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这个先要把基因组提取出来，然后把基因组做模板，对那个基因进行RT-PCR，如果所研究的某一基因的所有拷贝数都包含在基因组内的话，那么就可以确定原始的拷贝数，当然需要制作一个标准曲线的，（可以把那段基因当做定量的工具，先要准确定量好，浓度大一点的，就是说先定量一个ng级以上的标准模板，可以用紫外分光光度计或是nanodrop等仪器能够检测出的，然后梯度稀释，这样先制作成一个标准的曲线）这样可以根据RT-PCR的扩增Ct值代入到标准曲线里去求出拷贝数，当然模板要全部包含在基因组内。不知道我说的对不对，也就是你所说的实际上就是检测模板的浓度。 参看下RT-PCR原理看下啊 |
2楼2011-06-09 21:36:20
西瓜
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对您的看法持保留态度哦。 如果是两个不同的基因组，可以按照您的方法，把其中一个基因组的拷贝数看成1，另一个基因组与其进行比较（用比较Ct值法或者标准曲线的方法都可以）。但是楼主这里只有一个未知拷贝数的基因组，他的问题就等于是有待测样品，但是没有可以用于比较的标准品。 一般这种情况，应该先把目的基因克隆到质粒里面，然后用测OD260的方法可以测质粒浓度（也就知道了拷贝数，即copies/uL），再把质粒梯度稀释作为标准品，与样品基因组一起做实时荧光定量PCR（real-time PCR），梯度稀释的质粒可以做出标准曲线，这样就能知道样品基因组的拷贝数了。 质粒拷贝数可以这样计算： 质粒浓度（ng/uL）=OD260×50×稀释倍数 质粒分子量=碱基数×324 质粒拷贝数（copies/uL）=质粒浓度（ng/uL）÷质粒分子量×6×10^14（10的14次方） 个人意见，欢迎各位不吝赐教  |
3楼2011-06-09 23:37:05
beautybanana
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4楼2011-06-10 08:56:23
