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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：关于重组质粒目的条带丢失
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diduqiong

木虫 (初入文坛)

[求助] 求助：关于重组质粒目的条带丢失

提质粒酶切，做好的重组质粒有时候提得到含目的条带的有时候提出来酶切不开，电泳看看跟空载质粒一样大，都是从同一个划线平板上接的菌，这是为什么啊，跟培养时间有关系吗？难道培养的时间长了会把目的条带丢失吗？有木有童鞋跟我有一样的经历啊?
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狗屎养鲜花
1楼 2011-05-31 10:32:12
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-31 11:08:40
diduqiong(金币+1): 谢谢 2011-05-31 11:23:46
出现了假阳性，培养时间不能过长，时间太长会出现卫星菌落。
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2楼2011-05-31 10:53:47
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-05-31 12:45:43
diduqiong(金币+3): 2011-05-31 12:51:41
1:你确定你的目的条带连接上了吗？还是已经验证连接上了，然后提质粒觉得不对。
2：一般你的目的条带如果过于小的话，连到载体上，跑出来的电泳结果是和空载体一样大的，然后单酶切或者双酶切就可以看出来你连接的目的片段了。
3：建议你用你提的质粒当模板做个PCR看看有没有条带。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-05-31 12:07:08
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diduqiong

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-30 16:07:08:
1:你确定你的目的条带连接上了吗？还是已经验证连接上了，然后提质粒觉得不对。
2：一般你的目的条带如果过于小的话，连到载体上，跑出来的电泳结果是和空载体一样大的，然后单酶切或者双酶切就可以看出来你连接 ...

已经连上了，条带一千多，第一次接摇瓶提质粒，电泳验证比原质粒大，当时忘记做酶切验证一下，就划了线放冰箱里了，现在同一块平板上的接摇瓶过夜之后提出来电泳跟原来的差不多大，就想着酶切一下，竟然切不开了，这是怎么回事啊
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狗屎养鲜花
4楼2011-05-31 12:21:49
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seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
diduqiong(金币+1): 谢谢！做个PCR试试 2011-05-31 15:53:08
dhd997(金币+3): 欢迎交流 2011-06-01 08:33:25
我觉得您说的并不清楚；
既然是和空载一样，那么是没有克隆成功，这是必然的； 如果，说培养时间长，片段丢失，那是不可能的；

如果，你认为成功了，你随便切一个位点即可，和空载体比较分子量即可；或者PCR鉴定；或者测序；或者你的酶切位点对甲基化敏感。

希望对你有帮助
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5楼2011-05-31 14:42:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-06-01 08:33:38
引用回帖:
Originally posted by diduqiong at 2011-05-31 12:21:49:
已经连上了，条带一千多，第一次接摇瓶提质粒，电泳验证比原质粒大，当时忘记做酶切验证一下，就划了线放冰箱里了，现在同一块平板上的接摇瓶过夜之后提出来电泳跟原来的差不多大，就想着酶切一下，竟然切不开 ...

你最好划出单克隆验证一下，就是挑几个单克隆分别划线，然后进行PCR验证，我怀疑是不是你当时没有验证的菌不纯，里面有连接上的，也有空载体。。。很有可能噢。。。你说呢？
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6楼2011-05-31 15:54:34
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diduqiong

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-30 19:54:34:
你最好划出单克隆验证一下，就是挑几个单克隆分别划线，然后进行PCR验证，我怀疑是不是你当时没有验证的菌不纯，里面有连接上的，也有空载体。。。很有可能噢。。。你说呢？

恩，是的，我现在也在怀疑这个，当时划线的菌很可能不是但菌落，早上都要愁死啦，下午就有思路啦，谢谢大家！O(∩_∩)O~
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狗屎养鲜花
7楼2011-05-31 16:02:27
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匿名

用户注销 (小有名气)
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8楼2011-06-01 00:17:11
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漓江魂

铜虫 (小有名气)
楼主用的是什么感受态呀？  载体会不会是那种干扰rna 很容易重组的
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9楼2011-06-01 00:39:30
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diduqiong

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 漓江魂 at 2011-05-31 04:39:30:
楼主用的是什么感受态呀？  载体会不会是那种干扰rna 很容易重组的

什么是干扰RNA
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狗屎养鲜花
10楼2011-06-01 09:41:34
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