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天涯萧客

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【答案】应助回帖

直接买 beads GSH的

100年后地球照样转

2楼2011-05-31 11:16:54

张力民1598

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

如果你很确定你的蛋白有表达的话，从你描述的情况看肯定是没结合上去，你要确定你的buffer没有问题。

3楼2011-05-31 11:19:53

alfred023

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4楼2011-05-31 11:39:32

alfred023

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5楼2011-05-31 11:40:12

deblway

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【答案】应助回帖

建议检查下所用的Lysis buffer，如果标签和填料没有问题的话,很有可能是lysis buffer使得融合蛋白不与GSH结合。。。。附上配方。。
      Lysis buffer （50ml）
1)       2.5ml 1 M Tris，pH8.0
2)       0.1ml 0.5ml EDTA
3)       0.292g NaCl
4)       0.5ml Triton X-100
5)       0.25ml 1M DTT
u       Elution buffer
1)       0.615g glutathione
2)       10 ml 1M Tris，pH8.0
3)       90ml distilled water

海贼王！哥当定了。。。。

6楼2011-05-31 14:45:12

terry130

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【答案】应助回帖

可能的原因有很多呢，做实验有对照才好找问题，如果你同学做的也是GST标记的蛋白的话，他就是最好的对照，你把他用的bead要过来做一下你的蛋白试试。buffer都是照着配，错的可能性不大，相比之下bead出问题的可能性更大些、

摒气动方息，宁神心自明。

7楼2011-05-31 14:55:06

alfred023

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8楼2011-05-31 15:10:51

alfred023

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9楼2011-05-31 15:39:52

deblway

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【答案】应助回帖

实际上Lysis buffer的用处主要是防止非目的蛋白的非特异性结合用的，例如在HIS TAG亲和层析过程中的Lysis Buffer中是含有少量的咪唑浓度的，而Elution buffer
中咪唑浓度会高些！我们才用Lysis buffer进行菌体的悬浮。。个人认为DTT与巯基乙醇作用应该是一样的。。应该可以替换。。但应该准确控制浓度的问题。。如果过高的话，会改变你本身蛋白的一些性质和填料的一些性质。。按照你说的你与同学做的过程一样，是否连试剂用的都一样捏。。如果都一样的话，呵呵可能就是不BUFFER出的问题了。。那就的从你插入片段入手咯。。那就是本身蛋白出了问题了。。只是个人的一个看法。。。具体问题和过程还是您最清楚。。

海贼王！哥当定了。。。。

10楼2011-05-31 18:03:01