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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » GST融合蛋白纯化求助 ！！！
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漓江魂

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by deblway at 2011-05-31 18:03:01:
实际上Lysis buffer的用处主要是防止非目的蛋白的非特异性结合用的，例如在HIS TAG亲和层析过程中的Lysis Buffer中是含有少量的咪唑浓度的，而Elution buffer
中咪唑浓度会高些！我们才用Lysis buffer进行菌体的 ...

在 HIS 纯化中不一样呀    DTT可以将镍珠  氧化先变黄 在变黑  巯基乙醇就不会
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11楼2011-06-01 00:59:14
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漓江魂

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

那个  Elution buffer 中的还原型 谷胱甘肽 很容易被氧化  所以 要临用临配  要用新鲜的
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12楼2011-06-01 01:01:49
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gppwfh

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的loading buffer不适用于纯化GST.我们这里都是用PBS作为上样缓冲液的。你的情况，基本上可以断定，目的蛋白没有挂柱，所以应该从结合液方面考虑
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13楼2011-06-01 11:05:58
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alfred023

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
14楼2011-06-02 13:36:30
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gppwfh

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by alfred023 at 2011-06-02 13:36:30:
·结合液不就是PBS吗？？能不能指点一下结合液的配方？？

就是pbs,ph7.3
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15楼2011-06-02 18:42:16
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spark_online

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般情况多少都会有一些binding, 如果用SDS-PAGE gel 直接跑loading蛋白之后的beads，看不到beads上有蛋白，而且 loading buffer和lysis buffer都没有问题，GSH beads也没有问题，强烈怀疑是GST tag的问题，GST 的表达是否正确，plasmid有木有问题，正确表达的GST tag可以用anti GST antibody看一下
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16楼2011-06-04 12:26:49
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sunqi88315

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

蛋白与树脂结合的时间稍长些。2h以上，放在摇床里面摇
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17楼2011-07-11 18:44:01
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

可以明确的告诉你，填料没有问题 ，蛋白肯定是流传了，至于什么问题，和你同学做个好好的比较吧
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18楼2011-07-12 14:48:51
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Champanzee

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by deblway at 2011-05-31 14:45:12
建议检查下所用的Lysis buffer，如果标签和填料没有问题的话,很有可能是lysis buffer使得融合蛋白不与GSH结合。。。。附上配方。。
        Lysis buffer （50ml）
1)         2.5ml 1 M Tris，pH8.0
2)         ...

可以再加问一下吗？有了裂解液，洗脱液，可以再附上Binding buffer吗
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没有做不到只有想不到
19楼2016-02-29 10:15:02
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raoguibo

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
20楼2016-03-28 13:14:28
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