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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pMG36e 构建的奇怪现象
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] pMG36e 构建的奇怪现象

质粒构建在我们实验室已是常规操作，但是最近构建pMG36e时出现一个奇怪的问题：
转化后，在红霉素（200ug/ml）筛选LB培养基上，要么没有菌落，要么长出的菌落扩大后提不出质粒。（菌体抗药性突变？也太频繁了吧？几十个克隆都这样） 请各位帮忙分析下原因。

目的基因长度：1000~2000bp（几个基因）此载体也曾连上过300bp和2500bp的片段。
酶切位点：SacI和HindIII
感受态：全式金DH5a、自制高效感受态，已验证
质粒提取试剂盒：生工和鼎国小提试剂盒，已验证
连接酶：TaKaRa Solution I 和 T4连接酶，已验证
连接接比例：质粒:目的基因=1:4~1:10
连接时间：12~16小时
   以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题。
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1楼2011-05-24 17:38:33
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cicilyok

新虫 (初入文坛)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流！ 2011-10-15 15:34:13
楼主，你好！不知道你的问题现在解决没有 我现在用pMG36e也遇到奇怪现象。不知道你和各位有没有什么建议。我转化之后，整个平板长满，（就像平时抗生素失效一样），完全没有办法挑单克隆，感受态用的是大肠杆菌Origa，平板红霉素浓度为250ug/ml，红霉素配好以后，验证有效。还有我的目的片段是150-200之间，连接什么比例比较好呢
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10楼2011-10-15 12:33:33
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)
质粒小提试剂盒提取效率还是不错的，我们一般每9ml的菌液处理后，收集到一个50ul的收集管里，可以满足酶切检测的需要，克隆则是每200ML菌液常规提取后，沉淀用小提试剂盒1个管用量的溶液处理、收集（50ul，浓度可以满足酶切后回收的要求）。
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14楼2013-03-26 09:51:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:29
jayxj(金币+5): 非常感谢 2011-05-25 16:16:54
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个基因其实个人觉得关键在于连接和感受态细胞。。。按照你上面所述，连接体系应该也不会出现什么问题，连接时间可以稍微短一些，7小时---10小时试试。。。

另外抗生素有没有问题呢？浓度会不会太大了？

你的载体和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也会影响你后期的连接的。。。

可以变换体系再试试。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-24 19:54:46
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-24 19:54:46:
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个 ...

为了避免酶切不完全，我也用以前连上基因的载体（目的基因300bp）做模板酶切，切出片段后回收载体部分做连接，但出现前面相同现象。
如果说抗生素浓度过大，但平皿上仍有菌落长出，但却提不出质粒。红霉素降到150ug/ml则会出现更多杂菌。
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3楼2011-05-25 16:15:31
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-24 19:54:46:
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？

克隆一个 ...

怎么，刚回的帖子没有了？？？
为了避免酶切不完全，也曾用连上目的基因的重组载体酶切，切下条带后，回收载体部分连接信的目的基因，结果依然同前。
红霉素浓度曾降低到150ug/ml，但杂菌太多，所以放弃，即使现在用200ug/ml也有菌落长出，很少，但不含质粒。
连接时间，说实话，按说明书从30min~48小时都做过，没什么区别。
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4楼2011-05-25 16:23:06
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caojie107

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2011-05-26 18:47:03
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 很热心哦 2011-05-30 12:42:04
引用回帖:
Originally posted by caojie107 at 2011-05-26 18:47:03:
同学，问题可能出在感受态上吧，还有不知道你们实验室的质粒pMG36e 可不可以交换或者购买？

http://www.yrgene.com/index.php? ... p;id=5&Itemid=5
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6楼2011-05-30 09:33:01
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wangzhou79

铁杆木虫 (正式写手)
请问楼主，你在提取pMG36e空载的时候顺利么？我最近也在提取，载体在大肠杆菌DH5a内，加了抗生素可以生长，但是提取质粒电泳后就是看不见条带，不知道什么情况，我增加了菌液量也是不行，请问楼主在提取质粒的时候需要注意些什么？谢谢
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人若志趣不远，心不在焉，虽学无成！
7楼2011-06-08 10:52:40
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jayxj

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励帮助！ 2011-10-15 15:33:56
引用回帖:
Originally posted by wangzhou79 at 2011-06-08 10:52:40:
请问楼主，你在提取pMG36e空载的时候顺利么？我最近也在提取，载体在大肠杆菌DH5a内，加了抗生素可以生长，但是提取质粒电泳后就是看不见条带，不知道什么情况，我增加了菌液量也是不行，请问楼主在提取质粒的时候 ...

用阳性质粒转化大肠杆菌后，提取质粒没有什么问题。只是在连接产物转化后，经常碰到你所说的现象。解决方式是先做菌落PCR确定含有质粒后在对其实施提取质粒的操作，培养时间16-19h，一般用小提试剂盒提取（9ml菌液处理后，过一个柱子，用30-60ul溶液洗脱），常规碱裂解提取质粒，往往200ml起提，最后溶在50ulTER里。估计你用的是碱裂解法，菌液量也不够，pMG36e拷贝数不高，菌液少了很难提出来，试试试剂盒。
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8楼2011-06-09 14:53:17
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wangzhou79

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jayxj at 2011-06-09 14:53:17:
用阳性质粒转化大肠杆菌后，提取质粒没有什么问题。只是在连接产物转化后，经常碰到你所说的现象。解决方式是先做菌落PCR确定含有质粒后在对其实施提取质粒的操作，培养时间16-19h，一般用小提试剂盒提取（9ml ...

感谢楼主的建议，我用的也是试剂盒提取，可能是菌液量的问题，我再来试一试，很奇怪，我的就是阳性空载在大肠里就是这样不好提取，因为是从别人那里买的质粒，也不知道是不是他给我的质粒有问题，呵呵，总之，十分感谢楼主的建议！
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人若志趣不远，心不在焉，虽学无成！
9楼2011-06-10 20:11:12
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