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jayxj铁杆木虫 (小有名气)
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pMG36e 构建的奇怪现象
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质粒构建在我们实验室已是常规操作，但是最近构建pMG36e时出现一个奇怪的问题： 转化后，在红霉素（200ug/ml）筛选LB培养基上，要么没有菌落，要么长出的菌落扩大后提不出质粒。（菌体抗药性突变？也太频繁了吧？几十个克隆都这样） 请各位帮忙分析下原因。 目的基因长度：1000~2000bp（几个基因）此载体也曾连上过300bp和2500bp的片段。 酶切位点：SacI和HindIII 感受态：全式金DH5a、自制高效感受态，已验证 质粒提取试剂盒：生工和鼎国小提试剂盒，已验证 连接酶：TaKaRa Solution I 和 T4连接酶，已验证 连接接比例：质粒:目的基因=1:4~1:10 连接时间：12~16小时 以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题。 |
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wangzhou79
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