| 查看: 4891 | 回复: 29 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
jayxj铁杆木虫 (小有名气)
|
[求助]
pMG36e 构建的奇怪现象
|
|||
|
质粒构建在我们实验室已是常规操作，但是最近构建pMG36e时出现一个奇怪的问题： 转化后，在红霉素（200ug/ml）筛选LB培养基上，要么没有菌落，要么长出的菌落扩大后提不出质粒。（菌体抗药性突变？也太频繁了吧？几十个克隆都这样） 请各位帮忙分析下原因。 目的基因长度：1000~2000bp（几个基因）此载体也曾连上过300bp和2500bp的片段。 酶切位点：SacI和HindIII 感受态：全式金DH5a、自制高效感受态，已验证 质粒提取试剂盒：生工和鼎国小提试剂盒，已验证 连接酶：TaKaRa Solution I 和 T4连接酶，已验证 连接接比例：质粒:目的基因=1:4~1:10 连接时间：12~16小时 以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有241人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 做硅铁合金中碳量分析时用扫描电镜扫样品（烧后）的形貌后遇到的奇怪现象，求解释！
已经有4人回复
- 二硝化反应奇怪现象
已经有5人回复
- endnote 插入引用后发生很奇怪的现象。。求帮助
已经有26人回复
- 关于ansys ls-dyna结果显示的一个奇怪现象求助
已经有10人回复
- 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看
已经有10人回复
- 【求助】重金属浸出出现的奇怪现象，求解？
已经有24人回复
- fluent使用之奇怪现象
已经有12人回复
- 用DMF还原铜的奇怪现象
已经有6人回复
- 转化后提不出质粒
已经有11人回复
- 奇怪的现象！沉淀处于两种互不相溶的不良溶剂界面？
已经有7人回复
- 构建克隆载体时出现的问题
已经有11人回复
- 很奇怪的连接产物
已经有5人回复
- 很奇怪的现象，有做有机氯农药检测的虫吗？关于DDT及其异构体的疑问~~
已经有11人回复
- 红外光谱有奇怪现象，请帮忙
已经有6人回复
- 陶瓷热腐蚀后SEM表面上的奇怪现象（有图）
已经有35人回复
- 【求助/交流】电泳跑胶时出现奇怪现象
已经有14人回复
- 【讨论】三氟乙酸脱保护后很奇怪的现象
已经有8人回复
- 【求助/交流】pcr的奇怪现象
已经有26人回复
- 【求助】过柱中发现的奇怪现象
已经有15人回复
- 【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象
已经有13人回复
- 【求助】奇怪的现象，铜的表面生成一层蓝色松软物质是什么？
已经有10人回复
wangzhou79
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 6232.3
- 散金: 2243
- 红花: 1
- 帖子: 920
- 在线: 307.5小时
- 虫号: 848766
- 注册: 2009-09-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
9楼2011-06-10 20:11:12
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
-
专家经验: +57 - MolEPI: 106
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 0.263
- 金币: 16332.8
- 散金: 593
- 红花: 74
- 沙发: 9
- 帖子: 3652
- 在线: 289小时
- 虫号: 441757
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 微生物生理与生物化学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:29
jayxj(金币+5): 非常感谢 2011-05-25 16:16:54
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:29
jayxj(金币+5): 非常感谢 2011-05-25 16:16:54
|
其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？ 克隆一个基因其实个人觉得关键在于连接和感受态细胞。。。按照你上面所述，连接体系应该也不会出现什么问题，连接时间可以稍微短一些，7小时---10小时试试。。。 另外抗生素有没有问题呢？浓度会不会太大了？ 你的载体和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也会影响你后期的连接的。。。 可以变换体系再试试。。。 |
2楼2011-05-24 19:54:46
jayxj
铁杆木虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 7772.7
- 红花: 2
- 帖子: 294
- 在线: 175小时
- 虫号: 279527
- 注册: 2006-09-16
- 性别: GG
- 专业: 疫苗学
3楼2011-05-25 16:15:31
jayxj
铁杆木虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 7772.7
- 红花: 2
- 帖子: 294
- 在线: 175小时
- 虫号: 279527
- 注册: 2006-09-16
- 性别: GG
- 专业: 疫苗学
4楼2011-05-25 16:23:06
