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yanyuyu

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，PCR的电泳结果出了未知问题

这是我电泳的条带，应该在700BP和550BP出目的带，结果在最下面有很严重的拖尾，目的条带看不出来，请问各位大侠是什么原因？
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1楼 2011-05-19 10:05:42
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-19 12:33:00
1949stone(金币+2): 越看越有道理 2011-05-19 12:34:16
引用回帖:
Originally posted by yanyuyu at 2011-05-19 10:05:42:
这是我电泳的条带，应该在700BP和550BP出目的带，结果在最下面有很严重的拖尾，目的条带看不出来，请问各位大侠是什么原因？

在750bp和500bp（DL2000的marker是吧）处没有目的条带，没有扩增出产物，可能是引物或是PCR程序问题，再仔细核对下~做个温度梯度，不行的话就检查下引物的特异性了~
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2楼2011-05-19 11:01:25
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 来了 2011-05-19 12:31:59
marker 标记一下。
没有条带原因太多了：

1：PCR体系的问题 不知道你有没有进行温度梯度的设定呢？还有你的体系是怎么样的？
2：引物的退火温度和稀释的均匀程度也会影响PCR的效果。

重复做一次。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-05-19 11:55:58
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奔跑的西瓜

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-19 12:33:14
1949stone: 是非特异性 貌似 2011-05-19 12:33:47
貌似是降解了，你检下你的模板DNA吧，看看怎么样，或者是引物非特异性结合了
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4楼2011-05-19 12:23:10
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奔跑的西瓜

铜虫 (初入文坛)
如果是非特异性的可能是你DNA浓度低或者是DNTP浓度太高
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5楼2011-05-19 12:55:43
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ycyycy

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 同感 2011-05-19 16:22:45
拖尾可能是引物二聚体，上样量10微升吗？
换个温度和反应条件试一试，如果之前有人扩增过，请教一下前辈。
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6楼2011-05-19 14:05:54
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xwsooo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 简单可行 2011-05-19 16:23:10
blast下你的引物，看看特异性如何~~
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7楼2011-05-19 14:17:30
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yanyuyu

新虫 (初入文坛)
★ ★
西瓜(金币+2): 反馈很积极，要鼓励的，呵呵~下次把问题的补充放在1楼吧，点击下方的“编辑”就可以了。 2011-05-19 16:25:33
谢谢大家的热心，心里很温暖
这个本身就是退火温度的PCR，从左到右分别是55，57，61，63和65度。
反映体系是：ddH2O        17.5μL
10×Taq reaction buffer        2.5μL
dNTP（2.5mM）        1μL
P1（10μM）        1μL
P2（10μM）        1μL
基因组DNA        1μL
Taq DNA polymerase（2.5U/μL）        1μL
Total Vol.        25μL

55的在1000Bp左右有个微弱的带。。。
大家看这个体系有问题吗？
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8楼2011-05-19 14:18:13
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎交流 2011-05-19 16:25:51
看你的条带感觉没有P出来，（1）看体系是不是有问题，模板和引物确定正确；（2）是不是PCR条件有问题，比如退货温度是否合适
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9楼2011-05-19 14:19:06
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 欢迎新虫交流！ 2011-05-23 00:55:12
yanyuyu(金币+2): 谢谢你，我这个图本身就是梯度的PCR，有做了几次好了些，准备加大循环次数 2011-05-23 14:01:34
个人感觉：模板有些问题，楼主说是基因组DNA模板多大量（不是体积），前端不太像引物二聚体！估计PCR体系应该不会有问题吧。。体系出问题也就是特异性可能会有所差异。。总应该有带才是！按照你退火温度55时有1000bp的带而温度升高后同样位置没有条带估计是引物没有结合上。。引物的特异性也有些问题。。或者模板量太低。。建议做个NESTING PCR。。如果讨厌设计两套引物的话，最快的方法用你55度的PCR产物当模板。。再用你的引物P一次或者干脆加大循环数。。。看能不能出来。。目的带。。如果出来了再优化优化条件。。
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海贼王！哥当定了。。。。
10楼2011-05-21 15:26:40
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