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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 求助DGGE染色问题
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5018

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助DGGE染色问题

各位：小弟最近跑DGGE，不知道是哪里出问题，PCR产物的琼脂糖电泳条带都非常亮，但是跑DGGE的时候染色完后都出现一片明亮的条带，已经不是一次了，而且我同学也有这种情况出现，请各位帮忙分析下。使用的是super greenI染色，1.5微升用1XTAE稀释10000倍表面涂抹染色两次，每次15分钟。DNA模板为去年9月份提取的昆虫肠道总DNA，－20摄氏度保存，有反复冻融现象，如果是DNA问题，但是PCR产物使用琼脂糖检测都是非常好的条带。下面有附图










[ Last edited by 5018 on 2011-4-23 at 17:31 ]
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一杯香茗，一卷书，偷得半日闲散；一抹斜阳，一壶酒，愿求半世逍遥。
1楼 2011-04-22 13:54:54
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wwling

铜虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1): 积极交流奖 2011-04-26 11:17:22
PCR产物纯化了吗？从PCR产物普通电泳来看，好像有非特异带哦
  或者上样量太多了？
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2楼2011-04-24 19:02:32
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5018

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wwling at 2011-04-24 19:02:32:
PCR产物纯化了吗？从PCR产物普通电泳来看，好像有非特异带哦
  或者上样量太多了？

PCR不需要纯化的吧 而且非特异性扩增也是DNA 也得有条带啊 我现在的情况是PCR狠亮 但是DGGE没条带啊。
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一杯香茗，一卷书，偷得半日闲散；一抹斜阳，一壶酒，愿求半世逍遥。
3楼2011-04-25 23:19:34
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惟我独尊

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
reasonspare(金币+1): 积极交流奖 2011-04-26 11:17:31
是不是和你的电泳条件设置有关啊？你的梯度是多少啊？电压和时间呢？
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4楼2011-04-26 09:44:44
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5018

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2011-04-26 09:44:44:
是不是和你的电泳条件设置有关啊？你的梯度是多少啊？电压和时间呢？

应该没关系  梯度从30%－70%到最后的40%－50%，电压有200V跑5个小时，有120V跑16小时
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5楼2011-04-27 22:54:15
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caisanrenju

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
5018(金币+5): 2011-04-30 21:57:12
lstt09nk(金币+5): 不错~~ 2011-05-05 18:25:09
1. 想详细问一下梯度。如果第一张破了的胶浓度是30-70的话，建议楼主用35-60。50的浓度，不太确定能不能完全分开。
2. 看LZ说电泳的电压时间有120V，16h，不知道哪张胶是这个条件。如果是下边两个，估计问题就在这里了。告诉你一个秘密，电压乘以电泳时间（h）的乘积等于1000，是最好的。
3. PCR产物非特异带太多，一定要改进PCR条件，提高退火温度，最好降落PCR，然后再进行纯化
4. 还想问一下胶的浓度是多少（聚丙烯酰胺的浓度）？还有就是可否告知测的是哪一区的基因，因为看你的PCR产物<200bp（如果Mark是100bp的话），有点奇怪
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6楼2011-04-28 13:57:46
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wallace974

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

PCR产物没有优化好，非特异性扩增太多，建议做梯度优化，扩出单一条带再跑DGGE，否则smear难以避免
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万物一理，万法自然
7楼2011-04-28 17:17:05
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5018

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by caisanrenju at 2011-04-28 13:57:46:
1. 想详细问一下梯度。如果第一张破了的胶浓度是30-70的话，建议楼主用35-60。50的浓度，不太确定能不能完全分开。
2. 看LZ说电泳的电压时间有120V，16h，不知道哪张胶是这个条件。如果是下边两个，估计问题就在 ...

扩的是V6-V8区的，那个MARKER不是DL2000   的 。
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8楼2011-04-30 22:01:03
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5018

铁虫 (初入文坛)
谢谢各位，已经基本解决问题了。
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9楼2011-04-30 22:01:29
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匿名

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10楼2011-05-05 16:54:03
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